论文摘要
目的本实验通过综合运用体外细胞培养技术、细胞免疫组化技术、流式细胞仪技术及相关生化指标检测等多种方法初次研究不同浓度的氟对体外培养的脐静脉血管内皮细胞生长与功能的影响，观察不同氟浓度与血管内皮细胞活性与功能的关系，为探讨微量元素氟对人体的影响与作用提供有效的实验支持，丰富对氟的实验研究。材料与方法1、培养：以含有10％胎牛血清的DMEM培养基常规培养人脐静脉血管内皮细胞株304（HUECV-304），传代待细胞生长状态稳定后进行各项实验。2、制备单细胞悬液密度为0.8～1.0×105个／ml，种24孔板，待细胞贴壁后加入不同浓度的氟化钠溶液，每板均设对照组，于4、8、12、24、48小时观察细胞生长状况及细胞形态学变化，进行细胞计数，留取培养液待测。3、MTT实验检测细胞增殖情况：在氟处理后的96孔细胞培养板中每孔添加MTT试剂2μl（5mg／ml），37℃孵育4h、8h、12h、24h及48h后终止培养，小心弃去培养液，用胰酶消化细胞，每孔加入15μl二甲基亚砜（DMSO）溶解，振荡10min。用酶标分析仪在490nm波长下测其光吸收值（A），可间接反映细胞增殖情况。4、免疫组织化学：将消毒好的盖玻片放入24孔培养板，接种细胞，待细胞贴壁后加入各实验因素，培养24h后终止。除去培养液，PBS冲洗，滴加一抗二抗，显色前用镊子小心将盖玻片取出进行DAB显色，观察PCNA，Ki-67的表达。5、流式细胞术：待测细胞经离心—PBS冲洗—吹匀—固定—再离心—冲洗—吹打—染色（4℃，20～30分钟）后，400目尼龙网过滤后上机检测。Cell quest分析软件分析，用细胞分裂增埴指数（PI）表示相对增殖活力。PI=（S+G2／M）／（G0／G1+S+G2／M）。6、代谢功能检测：利用试剂盒对培养细胞的上清液中细胞脂质过氧化酶丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）和超氧化物岐化酶（SOD）进行检测。结果1、培养4h～48h时，120～240umol／L剂量组对血管内皮细胞增殖活力有明显刺激作用，表现为细胞数目增多，随着氟作用时间的延长及氟浓度的增加，刺激细胞增殖的能力明显减弱，在720～960μmol／L剂量时细胞改变最为明显，细胞数量减少，细胞形态发生了明显改变，细胞呈长梭形、星形，似成纤维细胞，内皮细胞收缩，细胞间隙加宽，胞浆中出现暗色颗粒。2、加氟培养后24h血管内皮细胞免疫组化显示120～240μmol／L剂量组的血管内皮细胞PCNA、Ki-67表达阳性率升高，表达率约为80％，而对照组及其480～600μmol／L剂量组表达相对较弱，约为40～45％，而720～960μmol／L剂量组表达率较低仅为20％左右。3、加氟培养后的血管内皮细胞功能受到了一定影响，MDA、SOD及NO含量发生了变化：随着氟浓度的逐渐升高，MDA的含量逐渐升高，NO的含量逐渐下降。SOD的含量在低浓度和作用时间不长时稍有增高，随后开始下降，结论1、体外培养的脐静脉血管内皮细胞其增殖速度会受多种因素的影响，我们通过实验发现氟对于体外培养的血管内皮细胞有刺激增殖和引起损伤的双重作用，这种作用与投氟的剂量及作用时间有关。2、实验中发现MDA、NO和SOD含量的变化与细胞生长状况相关，在细胞分裂增殖和损伤中发挥重要作用。3、氟对内皮细胞的损伤作用可能与氧自由基有关，具体作用机制有待下一步实验证实。