论文摘要
随着世界人口日益老龄化,脑血管疾病的发病率逐年升高,并以其高致死率和致残率给人类健康和生存造成严重威胁。而脑血流减少和缺血性脑损伤是诱发此类疾病的重要原因之一。但由于脑缺血疾病的复杂性,目前还没有十分有效的治疗方法。丰富环境干预已经被证实是一种简便有效的治疗康复手段,对于延缓衰老、增进智力也有一定作用。临床上急性脑缺血导致中枢神经系统的功能损伤,但在复灌后有不同程度的自发性功能恢复,在一定程度上与中枢神经系统,特别是缺血周边邻近组织内在的代偿能力有关。突触是一个有较大可塑性的结构,对细胞内外各种刺激敏感,并由此改变神经的传递功效。突触可塑性是神经功能重建的重要机制,在缺血后神经功能的恢复中起关键作用。突触后致密物（post synaptic density,PSD）中包含各种受体、信号蛋白、脚手架蛋白和细胞骨架蛋白,在受到细胞外信号刺激时,通过分子间的动态结合,起到细胞信号传递、细胞骨架锚定、受体转运、激活下游特异性信号转导通路等作用,从而影响神经传导功能,在突触可塑性、学习记忆和神经功能损伤中起重要作用。突触后致密物-95（post synaptic density protein 95,PSD-95）即是一种位于PSD上最具代表性的脚手架蛋白,通过对信号转导分子的整合作用调节突触活动。因此,设想如果丰富环境可影响脑缺血引起的突触界面结构变化,那么,作为PSD上脚手架蛋白的重要分子PSD-95的基因表达是否改变?本实验采用大鼠MCAO脑缺血模型,对以上问题进行了探讨。本研究通过右侧大脑中动脉栓塞（middle cerebral artery occlusion,MCAO）建立大鼠局部脑缺血再灌注模型和双侧颈总动脉重复结扎建立小鼠全脑缺血再灌注模型,综合应用开场行为、水迷宫等行为检测方法、结合透射电子显微镜、逆转录聚合酶链反应（reverse transcriptionpolymerase chain reaction,RT-PCR）RNA扩增等技术,研究了脑缺血引起学习记忆功能损伤的机制,并应用于丰富环境干预抗脑缺血引起学习记忆功能减退的研究。首先观察了脑缺血对脑功能损伤的影响。局部脑缺血再灌注大鼠和全脑缺血再灌注小鼠在新异环境中的自发活动和探究行为显著减少（P＜0.01,P＜0.05）,而丰富环境作用显著提高脑缺血大鼠和小鼠新异环境中的自发活动和探究行为（P＜0.01,P＜0.05）。前肢悬挂实验的结果显示,局部脑缺血再灌注和丰富环境作用均没有产生显著影响。水迷宫检测表明,局部脑缺血再灌注大鼠和脑缺血再灌注3d小鼠的空间学习记忆能力显著下降（P＜0.01,P＜0.05）。丰富环境作用显著改善局部脑缺血大鼠和脑缺血再灌注7d小鼠的空间学习记忆能力（P＜0.01,P＜0.05）,并且显著提高正常动物的学习记忆能力（P＜0.01）。跳台实验结果表明,局部脑缺血再灌注大鼠的逃避学习记忆能力较假手术下降（P＜0.05）,丰富环境作用提高了脑缺血大鼠的逃避学习记忆能力（P＜0.05）。提示,丰富环境对脑缺血再灌注引起的脑功能损伤均有促进恢复的作用,同时也提高正常动物的学习记忆能力。为了探讨丰富环境对脑缺血造成的脑梗死和细胞凋亡的影响,采用红四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC）染色法测定脑梗死灶:用苏木精—伊红（hematoxylin and eosin,HE）染色法检测神经细胞形态的变化:结合琼脂糖凝胶电泳、RT-PCR等技术,进一步观察DNA片段化和X-连锁凋亡蛋白的抑制剂（X-linked inhibitor ofapoptosis protein,XIAP）mRNA表达的变化。结果表明,丰富环境作用缩小大鼠脑梗死灶体积。局部脑缺血再灌注后缺血侧的感觉运动（sensorimotor,S1）皮层和海马CA1区出现细胞稀疏、排列紊乱无层次感,细胞体积缩小,形态不规则等一系列细胞损伤现象;丰富环境作用后脑缺血大鼠缺血侧海马CA1区的细胞排列层次紊乱程度降低,神经细胞排列紧凑。凝胶电泳结果表明,脑缺血再灌注2d DNA片段化严重,3d后明显减轻,7d后DNA片段化基本消失:丰富环境作用减轻DNA片断化程度;与之相对应,脑缺血再灌注后XIAP mRNA表达下调（P＜0.01）,随着再灌注时间的增长,其下调程度有所恢复,但与假手术组仍有显著差异（P＜0.01）。预先丰富环境干预没有影响缺血再灌注2～3d的小鼠皮层和海马的XIAP mRNA表达,但使缺血再灌注7d皮层的XIAP表达显著回升（P＜0.05）。提示,丰富环境作用能够一定程度上调XIAP基因表达,抑制细胞凋亡,从而降低脑缺血造成的细胞损伤。本研究应用电镜观察了皮层S1区和海马CA1区的突触数密度和突触界面结构参数。结果表明,MCAO显著降低大鼠缺血侧皮层总的突触数密度和穿孔突触数密度（P＜0.01）,同时也降低缺血侧海马的穿孔突触数密度（P＜0.01）;丰富环境作用的MCAO大鼠的缺血侧皮层的总的突触数密度和穿孔突触数密度显著回升（P＜0.01）,同时对缺血侧和缺血对侧海马的穿孔突触数密度也有提高作用（P＜0.01）。突触界面结构的观测结果显示,缺血侧皮层S1区和海马CA1区突触间隙宽度增大（P＜0.01）,PSD厚度变薄（P＜0.01）,活性带长度变短（P＜0.05,P＜0.01）,突触界面曲率变小（P＜0.05,P＜0.01）:丰富环境能有效抑制缺血诱导的突触界面部分结构参数的变化,包括皮层和海马的突触间隙宽度显著缩小（P＜0.01）,PSD厚度增厚（P＜0.01）:并且对假手术大鼠海马PSD厚度也有增厚作用（P＜0.01）。进一步应用RT-PCR技术分析大鼠皮层和海马的PSD-95mRNA的表达结果显示,丰富环境作用能够有效地上调脑缺血导致的PSD-95 mRNA表达的下降（P＜0.01）。提示丰富环境改善脑缺血和假手术大鼠的空间学习记忆能力可能与其促进脑缺血区边缘组织突触界面结构修饰,提高PSD-95 mRNA表达有关。综上所述,丰富环境可在不同层面上影响脑缺血造成的损伤。从整体上看,丰富环境作用能够改善脑缺血再灌注引起的脑功能损伤,提高学习记忆能力:细胞形态上,丰富环境作用一定程度地抑制脑缺血引起的细胞凋亡,减轻细胞损伤,缩小缺血灶大小。亚细胞和分子层面上,丰富环境干预能抑制局部脑缺血导致的突触数密度减少;不同程度地逆转脑缺血造成的突触界面参数,特别是PSD厚度和突触间隙宽度的变化,并有效地上调与突触界面结构密切相关的脚手架蛋白PSD-95 mRNA表达。