番茄叶绿体LesAPX和Cu/Zn-SOD的克隆及功能分析

论文摘要

在低温弱光下,植物体内易产生过量的活性氧（Reactive oxygen species, ROS）,从而对植物造成伤害。叶绿体在各种胁迫条件下能产生大量的ROS。叶绿体中两个重要的ROS清除酶是超氧化物歧化酶（SOD）和抗坏血酸过氧化物酶（APX）,SOD催化两分子O2?岐化为O2和H2O2,APX利用AsA作为电子供体将H2O2还原为水。本研究以番茄为实验材料,通过RT-PCR克隆了叶绿体基质抗坏血酸过氧化物酶（sAPX）和Cu/Zn-SOD基因,同源性比较证明所克隆的基因是目的基因。主要研究结果如下:1.利用同源序列设计简并引物,通过RT-PCR的方法从番茄叶片克隆sAPX基因的中间片段,通过5’-RACE和3’-RACE分别克隆到5’和3’片段,拼接后设计特异引物扩增到全长cDNA,命名为LesAPX（EU251405）。该基因全长为1435 bp,ORF为960 bp,编码320个氨基酸。同源序列比较表明,LesAPX基因的序列与烟草、拟南芥、豇豆、菠菜等叶绿体基质抗坏血酸过氧化物酶基因的序列有较高的同源性。2.将获得的LesAPX基因与含有35S启动子的pBI121载体重组,构建了反义表达载体,利用农杆菌介导的叶盘法转化烟草,用PCR的方法对带卡那抗性的转基因番茄植株进一步检测,获得了转反义基因的烟草植株。经检测LesAPX基因表达发生沉默的烟草植株中APX和SOD酶活性下降,并且转反义基因植株PSⅡ的最大光化学效率（Fv/Fm）和实际光化学效率（ΦPSⅡ）均明显低于野生型。3.将从番茄中克隆得到叶绿体Cu/Zn-SOD基因,与含有35S启动子的pBI121载体重组,分别构建了正义和反义表达载体,利用农杆菌介导的叶盘法转化烟草,用PCR方法对带卡那抗性的转基因烟草植株进一步检测,获得了转正义和反义基因的烟草植株。4.构建了原核表达载体pET-SOD,并在大肠杆菌BL21中表达融合蛋白,免疫小白鼠,制备抗体,其抗血清效价为1:500。Western杂交表明,转正义植株中Cu/Zn-SOD基因已在蛋白水平过量表达。5.选取野生型、转正义Cu/ZnSOD基因株系S（+）21和转反义Cu/ZnSOD基因株系S（-）8为试材,测定了低温弱光胁迫下光合参数、叶绿素荧光参数、叶绿素a快速荧光诱导曲线（OJIP）和活性氧清除酶活性。与野生型相比,转正义基因植株S（+）21的PSⅡ最大光化学效率（Fv/Fm）和光合速率（Pn）下降程度较小,而转反义基因植株S（-）8的下降较明显。与WT相比,低温弱光胁迫下转正义基因植株S（+）21维持较高的叶绿体超氧化物歧化酶（SOD）和抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性,O2?和H2O2的含量较低。通过分析快速叶绿素a荧光动力学曲线（OJIP）的参数,探讨了低温弱光胁迫下Cu/ZnSOD基因对光系统Ⅱ（PSⅡ）功能的影响。与野生型相比,转正义基因植株耐低温能力强,能维持较高的电子传递速率。这些结果表明Cu/ZnSOD的过量表达增强叶绿体的抗氧化系统。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩写符号及其中英文对照
• 1 引言
• 1.1 低温胁迫对植物的影响
• 1.1.1 低温对光合作用的影响
• 1.1.2 低温条件下的光抑制
• 1.1.3 低温胁迫下的光破坏防御机制
• 1.2 抗氧化酶的作用机理
• 1.2.1 抗坏血酸过氧化物酶的代谢途径
• 1.2.2 超氧化物岐化酶的代谢途径
• 1.3 本研究的目的、意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 番茄叶绿体基质抗坏血酸过氧化物酶基因的获得
• 2.2.1.1 总 RNA 的提取
• 2.2.1.2 cDNA 第一条链的合成
• 2.2.1.3 cDNA 纯化
• 2.2.1.4 对cDNA 进行末端加尾
• 2.2.1.5 番茄叶绿体基质抗坏血酸过氧化物酶基因全长的克隆
• 2.2.1.6 LesAPX 反义表达载体的构建
• 2.2.2 番茄叶绿体 Cu/Zn-SOD 基因的获得
• 2.2.2.1 番茄叶绿体 Cu/Zn-SOD 基因真核表达载体的构建
• 2.2.2.2 转基因烟草植株的 PCR 检测
• 2.2.2.3 Cu/Zn-SOD 基因原核表达及 Western 杂交
• 2.2.3 各项生理指标的测定
• 2.2.3.1 活性氧清除酶的活性测定
• 2.2.3.2 组织化学染色
• 2.2.3.3 荧光参数测定
• 2.2.3.4 快速荧光诱导曲线的测定
• 2.2.3.5 光合气体交换参数的测定
• 2.2.3.6 盐胁迫下的种子发芽试验
• 3 结果与分析
• 3.1 番茄叶绿体基质抗坏血酸过氧化物酶基因的分离及表达
• 3.1.1 LesAPX 基因的分离
• 3.1.2 LesAPX 基因的序列分析
• 3.1.3 LesAPX 基因表达载体的构建及转基因体系的建立
• 3.1.3.1 LesAPX 基因表达载体的构建
• 3.1.3.2 转反义 LesAPX 基因烟草植株的鉴定
• 3.1.4 LesAPX 基因在烟草中的表达分析
• 3.2 番茄叶绿体 Cu/Zn-SOD 基因的分离及表达
• 3.2.1 番茄叶绿体 Cu/Zn-SOD 基因的分离
• 3.2.2 原核表达载体pET-Cu/Zn-SOD 的构建及原核表达分析
• 3.2.3 Cu/Zn-SOD 基因正、反义表达载体的构建
• 3.2.4 转正、反义 Cu/Zn-SOD 基因烟草植株的鉴定
• 3.2.5 Westen blot 检测分析
• 3.2.6 低温弱光胁迫对转 Cu/Zn-SOD 基因烟草自由基清除酶系统的影响
• 3.2.7 低温弱光胁迫对转 Cu/Zn-SOD 基因烟草活性氧产生量的影响
• 3.2.8 低温弱光胁迫对 Cu/Zn-SOD 基因烟草植株荧光参数的影响
• 3.2.9 低温弱光胁迫对转 Cu/Zn-SOD 基因烟草快速荧光诱导曲线的影响
• 3.2.10 低温弱光胁迫对转 Cu/Zn-SOD 基因烟草植株光合速率的影响
• 3.2.11 盐胁迫处理对转 Cu/Zn-SOD 基因烟草种子发芽率的影响
• 4 讨论
• 4.1 番茄基质抗坏血酸过氧化物酶的功能
• 4.2 番茄叶绿体 Cu/Zn-SOD 基因的功能
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的论文