药用植物抗菌内生菌的分离鉴定及其生物学性质研究

论文摘要

植物内生菌普遍存在于植物体中,由于其生活环境的特殊性,植物内生菌与宿主植物之间形成了一种共生关系。近年来的研究表明,植物内生菌具有抗菌、抗肿瘤、杀虫、抗病毒、抗氧化等活性。这使得植物内生菌成为人们寻找新型抗菌、抗肿瘤药物的重要资源。本课题主要是以具有抗菌活性的药用植物为分离材料,筛选具有广谱抗菌活性的植物内生菌,对活性菌株进行形态及分子生物学鉴定,以及对川黄檗内生真菌PE-S11生长条件进行优化。得到的实验结果如下:①采用本课题前期建立的表面消毒方法,从采集自重庆歌乐山、南山、贵阳等地的款冬、金荞麦等15种药用植物中,分离出了117株植物内生菌。其中内生细菌34株,内生真菌83株。有23株（8株细菌, 15株真菌）在体外不能生长。分离到的内生真菌在27℃条件下培养大多不产生孢子。②采用酒精沉淀法对植物内生菌发酵液进行预处理,结果94株内生菌中, 67株对一种或多种指示菌具有抑制作用;其中有11株对4种以上人畜病原菌有抑制作用;款冬内生真菌（TE-R7）、金荞麦内生真菌（FE-R9）和川黄檗内生真菌（PE-S11）对10种以上指示菌有不同程度的抑制作用。③参照《真菌鉴定手册》和《真菌分类学》,通过形态培养,显微观察和对三株内生菌做18S rDNA序列测定,比对发现,款冬内生真菌TE-R7与镰孢霉属（Fusrium sp.）的fusarium oxysporum f.cubense（EF590328）具有99%的同源性,与镰孢霉属的其他种相似性有98%-99%。为镰孢霉属（Fusarium）,fusarium oxysporum f.cubense菌的不同菌株。金荞麦内生真菌FE-R9与镰孢霉属（Fusrium sp.）的fusarium oxysporum具有100%同源性,与镰孢霉属的其他种相似性有98%-100%,因此FE-R9为镰孢霉属（Fusarium）,尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）。川黄檗内生真菌PE-S11与丛赤壳属（Nectria）的Nectria sp. GD507具有98%的同源性,与丛赤壳属其他种的同源性在96%-98%,PE-S11可能与丛赤壳属（Nectria）的Nectria sp.菌为同一个种。④对Nectria sp.菌株PE-S11生长条件进行优化。该菌在以马铃薯汁为基本培养基,27℃的培养温度,6.0-7.0的起始PH,30%的装液量,120r/min的摇床转速,2%的葡萄糖（或蔗糖）为碳源,0.3%的蛋白胨为氮源的条件下,培养7-9d。发酵液抗菌活性研究发现,丛赤壳属Nectria sp.菌株PE-S11对6种指示菌的抑制效果基本趋于稳定。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 绪论
• 1.1 引言
• 1.2 植物内生菌的概况及研究进展
• 1.2.1 植物内生菌的发展
• 1.2.2 植物内生菌的多样性
• 1.2.3 植物内生菌的生物学作用
• 1.3 植物内生菌生物活性及活性代谢产物研究
• 1.3.1 植物内生菌抗菌活性的普遍性
• 1.3.2 植物内生菌抗菌物质的多样性
• 1.3.3 植物内生菌抗肿瘤活性
• 1.3.4 其他活性
• 1.4 植物内生菌筛选抗菌活性物质的理论基础
• 1.5 植物内生菌的分离鉴定
• 1.6 研究存在的问题与展望
• 1.7 本课题的研究内容、目的、意义及技术路线
• 2 植物内生菌的分离和纯化
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物内生菌分离材料
• 2.1.2 实验试剂
• 2.1.3 分离和纯化培养基
• 2.1.4 主要仪器设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 植物样本的处理
• 2.2.2 植物内生菌的分离
• 2.2.3 植物内生菌的纯化
• 2.2.4 植物内生菌的菌种保存
• 2.2.5 植物样本表面消毒检验
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 表面消毒结果检验
• 2.3.2 植物内生菌的分离
• 2.4 本章小结
• 3 具有广谱抗菌活性植物内生菌的筛选
• 3.1 材料
• 3.1.1 实验菌株
• 3.1.2 培养基
• 3.1.3 仪器
• 3.2 方法
• 3.2.1 植物内生菌液体培养及发酵液处理
• 3.2.2 抗菌活性的测定
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 具有抗菌活性植物内生菌的筛选
• 3.3.2 三株具广谱抗菌活性植物内生菌的抗菌效果
• 3.3.3 三株植物内生菌对10 种指示菌的最低抑菌浓度（MIC）
• 3.4 本章小结
• 4 三株活性菌株的形态及分子生物学鉴定
• 4.1 材料
• 4.1.1 菌株来源
• 4.1.2 培养基
• 4.1.3 主要试剂
• 4.1.4 主要仪器设备
• 4.2 方法
• 4.2.1 三株活性菌株的形态观察
• 4.2.2 18S rDNA 序列的PCR 扩增和序列测定
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 三株活性菌株的形态特征
• 4.3.2 PCR 扩增和序列测定
• 4.3.3 三株活性菌株的系统发育分析
• 4.4 本章小结
• 5 川黄檗内生真菌Nectria sp.菌株PE-S11 的生长优化
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 方法
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 不同培养基对菌株生长及抗菌物质产生的影响
• 5.2.2 初始PH 对菌株生长及抗菌物质产出的影响
• 5.2.3 生长温度对菌株生长及抗菌物质产出的影响
• 5.2.4 培养时间对菌株生长及抗菌物质产出的影响
• 5.2.5 溶氧量对菌株生长及抗菌物质产出的影响
• 5.2.6 不同碳源对菌株生长及抗菌物质产出的影响
• 5.2.7 不同氮源对菌株生长及抗菌物质产出的影响
• 5.2.8 验证试验
• 5.3 本章小结
• 6 结论与展望
• 6.1 植物内生菌的分离
• 6.2 抗菌活性植物内生菌的筛选
• 6.3 三株活性菌株的菌种鉴定
• 6.4 Nectria.sp 菌株PE-S11 生长条件优化
• 6.5 后续工作展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录