论文题目: 钝齿棒杆菌精氨酸生物合成基因簇的研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 发酵工程
作者: 陈雪岚
导师: 陶文沂
关键词: 精氨酸,钝齿棒杆菌,钝齿棒杆菌,基因敲除,表达载体,基因,基因,基因,基因
文献来源: 江南大学
发表年度: 2005
论文摘要: L-精氨酸是人体代谢的一种重要氨基酸。随着人们对它研究的深入,发现精氨酸在食品和医药等方面有广泛的应用前景。本文以我国氨基酸生产常用的菌株钝齿棒杆菌A.S.1.542和本实验室保存的经亚硝基胍诱变的钝齿棒杆菌A.S.M2(精氨酸的产量能达2mg/mL)为研究对象,首次报导了钝齿棒杆菌A.S.1.542生物合成精氨酸的相关基因的信息,并与钝齿棒杆菌A.S.M2的相应基因进行了比较;同时,通过基因敲除技术分析了精氨酸生物合成中的一个调控基因argR的功能,并构建表达载体pC2-P-argR-T以考察argR基因对钝齿棒杆菌A.S.M2产精氨酸的影响。本文同时采用亲和层析的方法对钝齿棒杆菌A.S.M2产精氨酸关键酶进行了研究。主要研究结果如下:1通过Southern Blotting实验,以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的argB基因为探针,确定钝齿棒杆菌A.S.1.542与谷氨酸棒杆菌ATCC 13032有较高的同源性。据此,本实验以谷氨酸棒杆菌产精氨酸的串联基因的序列为主,同时比对已报道的Corynebacterium diphtheriae gravis NCTC13129、Corynebacterium efficiens YS-314和Mycobacterium tuberculosis CDC1551生物合成精氨酸基因簇argCJBDFR的保守序列,设计了四对特异引物,采用PCR的方法从钝齿棒杆菌A.S.1.542中扩增了长为6080bp的序列,其中argJ、argB、argD、argF和argR获得完整开放阅读框,argC获得部分开放阅读框。通过Blastp比对,分析了这5个完整开放阅读框的特征信息。2采用同样的四对特异引物,通过PCR方法从钝齿棒杆菌A.S.M2中扩增了长为6083bp的序列,同样获得5个完整的开放阅读框。比较了钝齿棒杆菌A.S.M2和钝齿棒杆菌A.S.1.542这5个基因的不同,从生物信息学上分析钝齿棒杆菌A.S.M2产精氨酸得以提高的可能原因。3鉴于argR基因的活跃性,本实验构建了一个敲除型质粒pGEM-T-RKR分析钝齿棒杆菌中argR基因的功能。通过分析精氨酸的产量和argB基因编码的乙酰谷氨酸激酶的含量,推断argR基因在钝齿棒杆菌生物合成精氨酸途径中扮演正调控因子。同时构建了一个表达型载体pC2-P-argR-T以考察argR基因对钝齿棒杆菌A.S.M2产精氨酸的影响,结果显示没有达到使精氨酸产量提高的目的。4采用亲和层析和SDS-PAGE方法分析钝齿棒杆菌产精氨酸关键酶。实验表明此菌
论文目录:
中文摘要
英文摘要
第一章 前言
1.1 L-精氨酸的性质、应用和生产现状
1.1.1 L-精氨酸的性质
1.1.2 L-Arg 的生理作用与应用
1.1.3 生产现状
1.2 L-Arg 的生产方法
1.2.1 传统诱变育种生产L-Arg
1.2.2 利用基因工程技术生产L-Arg
1.3 立题背景及本文的研究任务
第二章 钝齿棒杆菌生物合成精氨酸关键酶分析
2.1 材料和方法
2.1.1 仪器和试剂
2.1.2 菌株和培养基
2.1.3 关键酶的分析
2.1.4 乙酰谷氨酸激酶活力测定
2.1.5 乙酰谷氨酸激酶的理化性质
2.2 结果与讨论
2.2.1 钝齿棒杆菌产精氨酸关键酶分析
2.2.2 乙酰谷氨酸激酶的部分酶学性质
2.2.3 金属离子、螯合剂及DTT 对酶的活性的影响
2.3 本章小结
第三章 谷氨酸棒杆菌生物合成精氨酸途径中argB 基因的克隆、表达及与钝齿棒杆菌argB 基因的同源性
3.1 材料和方法
3.1.1 材料
3.1.2 方法
3.2 结果
3.2.1 PCR扩增argB基因
3.2.2 克隆质粒的菌落PCR及酶切鉴定
3.2.3 argB 基因在大肠杆菌的初步表达
3.2.4 探针的制备
3.2.5 探针质量检测
3.2.6 C.crenatum 基因组的酶切
3.2.7 Southern blotting 分析C.crenatum 与C.glutamcium 的argB 基因同源性
3.3 讨论
3.4 本章小结
第四章 钝齿棒杆菌生物合成精氨酸基因簇argCJBDFR 的扩增及序列分析
4.1 材料和方法
4.1.1 材料
4.1.2 方法
4.2 结果
4.2.1 各对引物PCR扩增
4.2.2 序列分析
4.3 讨论
4.4 本章小结
第五章 野生型和突变型钝齿棒杆菌生物合成精氨酸基因簇argCJBDFR 的序列比较
5.1 材料和方法
5.1.1 菌种、试剂和仪器
5.1.2 方法
5.2 结果
5.2.1 PCR扩增串联基因簇argCJBDFR
5.2.2 argJ 基因
5.2.3 argB 基因
5.2.4 argD基因
5.2.5 argF 基因
5.2.6 argR 基因
5.3 讨论
5.4 本章小结
第六章 钝齿棒杆菌精氨酸生物合成途径中argR 基因的功能分析及其高表达对C.crenatum A.S.M2 产精氨酸的影响
6.1 材料和方法
6.1.1 材料
6.1.2 方法
6.2 结果与讨论
6.2.1 敲除型载体的构建及C. Crenatum A.S.M2 中argR 基因的敲除
6.2.2 表达载体的构建及其在C. Crenatum A.S.M2 中的表达
6.3 本章小结
参考文献
论文主要结论、创新点及展望
致谢
发表论文
发布时间: 2006-07-20
参考文献
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