大肠埃希菌超广谱β-内酰胺酶CTX-M-14亚型的研究

论文摘要

背景与目的:产生超广谱β-内酰胺酶（Extended-spectrumβ-lactamases ESBLs）是导致肠杆菌科细菌对第三代头孢菌素耐药的最常见机制,ESBLs的主要宿主菌为大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌。ESBLs基因主要定位于质粒,可水解氧亚氨基头孢菌素类和单环β-内酰胺类抗生素,其酶活性可被内酰胺酶抑制剂抑制。目前,ESBLs种类已有数百种之多,包括TEM型、SHV型、CTX-M型、OXA型、其它型等5类。携带ESBLs的质粒可在同种甚至不同种的细菌之间传播,造成耐药菌株迅速增多,导致医院感染的暴发流行,是临床防治非常棘手的问题。目前对ESBLs的研究已经进入亚型研究阶段。由于地域、环境、医疗水平的差异,以及抗生素应用习惯不同,世界各地ESBLs流行的主要亚型及其耐药谱有所差异。有报道表明,在我国以CTX-M型为主,其中最主要的是CTX-M-14。国内有些地区作了这方面的调查和研究,但我省有关这方面的报道较少,尚缺乏系统的研究。为了解本地区临床分离大肠埃希菌中CTX-M-14型ESBLs的流行状况、以及耐药特征,本文对156株大肠埃希菌进行了CTX-M-14基因及表达蛋白的研究。方法:1.收集目的菌株:收集郑州大学第一附属医院2006年10月至2007年10月分离的产ESBLs大肠埃希菌156株。细菌鉴定采用双纸片协同试验初筛、E-test试验确证。每株均提取质粒,采用CTX-M-14特异性引物,聚合酶链反应（PCR）扩增CTX-M-14编码基因片段,琼脂糖凝胶电泳观察结果,统计CTX-M-14型ESBLs的检出率。2.目的基因的酶切、连接和转化:胶回收阳性片段,经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后,克隆入pET28（a+）载体中,转化于大肠杆菌BL-21感受态细胞,提取重组质粒并测序,分析其氨基酸序列,证明其为目的基因CTX-M-14。3.表达蛋白:采用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导CTX-M-14基因表达,超声处理法裂解表达产物包涵体,用低浓度尿素透析纯化和复性,得到较纯的CTX-M-14蛋白,按直接药敏试验的方法,将CTX-M-14蛋白加在水解酪蛋白（M-H）琼脂平板表面不同药敏纸片上,与不加CTX-M-14蛋白药敏纸片的抑菌环直径比较来判断酶活性。4.转化子耐药谱分析:将BL-21-CTX-M-14转化子采用液体稀释法进行药敏试验,检测其抗药活性。结果:1.对156株产ESBLs大肠埃希菌的质粒进行PCR扩增,结果显示67株阳性,检出率为42.9%。阳性片段在Marker750bp与1000bp之间。2.PCR产物经胶回收、酶切、连接后,转化入大肠杆菌BL-21感受态细胞,提取转化后CTX-M-14-BL-21大肠杆菌的重组质粒,并经同样的酶切后,产生的片段电泳位置与PCR产物一致。重组质粒经测序分析,共测得876bp,与GeneBank中CTX-M-14基因同源性为100%。3.在蛋白活性分析中,聚丙烯酞胺凝胶电泳显示目的条带在27.0kD与30.0kD之间,与CTX-M-14蛋白28kD相符。4.药敏试验结果显示,转化子对青霉素类、头孢一、二代及三代中头孢噻肟、头孢曲松耐药。对庆大霉素、四环素、喹诺酮类药物、碳青酶烯类敏感。对加有酶抑制剂的抗菌素和头孢他啶体外试验均敏感。结论:河南地区临床分离大肠埃希菌具有较高的CTX-M-14型ESBLs检出率,是本地区产ESBLs大肠埃希菌中流行的主要基因型。在蛋白活性测定中,采用透析纯化和低浓度尿素复性容易获得成功。CTX-M-14转化子具有广泛抗药活性,且与文献报道的该型ESBLs的耐药谱相似。临床上需要加强产CTX-M-14型ESBLs菌株检测及其感染的防治。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 正文部分 大肠埃希菌超广谱β-内酰胺酶CTX-M-14亚型的研究
• 引言
• 材料与方法
• 结果
• 结论
• 讨论
• 参考文献
• 综述部分 CTX-M型ESBLs的研究进展
• 参考文献
• 附录部分
• 中英文缩略词表
• 攻读硕士期间发表论文情况
• 致谢