猪附红细胞体病的诊断及其病原体的免疫原性分析

论文摘要

猪附红细胞体（Mycoplasma suis, M.suis）是一种寄生于猪血液中的一种微生物,能够引起猪的发热、贫血、黄疸等症状的血液感染性疾病。长期以来,由于该病多呈隐性感染,发病率较低,未引起人们的足够重视。目前,猪附红细胞体病在全国范围内呈大面积爆发和流行,对我国的养殖业造成了重大的经济损失。但是,我们对于该病的诊断治疗和预防仍然没有较为有效的方法。同时国内外对猪的研究相对较少,有关形态学特性、分类地位、诊断准确性、有效预防等问题都有待进一步研究。所以为了有效的控制该病的发生,我们必须对该病原进行深入的研究。本试验采用在泰安地区猪场搜集的疑似病例进行以下三个方面的研究:首先,观察发病猪的临床症状,主要表现为:发热、黄疸、呼吸急促、尿液浓黄,耳尖、四肢末端皮肤发紫;其病理学表现为:肺出血、水肿,肝脏、脾脏、淋巴结肿大,胃粘膜明显出血、溃疡。然后,对血液样本进行血涂片、吉姆萨染色和瑞氏染色。显微镜观察发现,发现红细胞呈多形性,吉姆萨染色,M.suis被染成淡紫色;瑞氏染色,被染成紫色。并且,无菌采集血液并提取DNA模板;利用16SrRNA的一对通用引物,对猪附红细胞体基因组DNA进行PCR鉴定,扩增出1400bp的特异性片段,与预期结果一致。该方法特异、灵敏、快熟,可从分子水平上对附红细胞体进行诊断。其次,无菌法采取自然发病的猪附红细胞体病的血液,从血液中分离M.suis,然后提取其基因组DNA。利用能扩增多种动物血营养菌部分16SrRNA基因的通用引物进行PCR扩增,结果扩增出大小约为1400bp的DNA片段。对PCR产物进行测序并作系统进化树,结果与美国基因库中的Illinois株同源性达97%以上。最后,我们从自然感染的猪血液中纯化猪附红细胞体,应用SDS-PAGE和免疫印迹试验对猪附红细胞体抗原蛋白组分进行初步分析。通过SDS-PAGE分离得到主要有13种蛋白质,其蛋白分子量范围为15Kd-170kD,分别是120kD,112kD,110kD,108 kD,68.2 kD,58.9kD,49.6kD,41.2kD,30kD,29kD,26.2kD,25kD,24.3kD。应用免疫印迹试验筛选出了6种特异性蛋白质,分子量分别是108kD,98.2kD,68.2kD,41.2kD,35kD,31kD。本实验对防制附红细胞体病,制备特异性诊断抗原,提高血清学诊断的特异性和准确性以及研制高效疫苗具有重要意义

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 前言
• 1.1 猪附红细胞体概述
• 1.1.1 病原学
• 1.1.2 流行病学
• 1.1.3 临床症状
• 1.1.4 血液学指标变化
• 1.1.5 病理变化
• 1.1.6 致病机理
• 1.1.7 诊断
• 1.1.8 抗原分析
• 1.1.9 防治措施
• 1.1.10 研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验动物及仪器设备
• 2.2 试剂
• 2.3 试剂配制
• 2.4 血涂片染色镜检
• 2.5 临床症状诊断
• 2.6 病理学观察
• 2.7 引物设计合成
• 2.8 DNA 模板提取
• 2.9 PCR 反应程序
• 2.10 琼脂糖凝胶电泳
• 2.11 PCR 产物的回收与纯化
• 2.12 克隆载体与目的DNA 的链接
• 2.13 感受态细胞的制备
• 2.14 转化与涂板
• 2.15 阳性克隆的筛选
• 2.16 质粒抽提
• 2.17 PCR 和酶切鉴定
• 2.18 测序
• 2.19 序列同源性比较和系统进化分析
• 2.20 附红细胞体解离方法测序
• 2.21 M.suis 抗原蛋白的western-blot 检测
• 3 结果
• 3.1 临床症状诊断结果
• 3.2 病理学结果
• 3.3 血涂片染色镜检结果
• 3.4 PCR 结果
• 3.5 临床样品检测结果
• 3.6 酶切鉴定结果
• 3.7 测序结果
• 3.8 猪附红细胞体的解离
• 3.9 纯化抗体浓度检测结果
• 3.10 SDS-PAGE 检测蛋白结果
• 3.11 western blot 结果
• 4 讨论
• 4.1 临床症状及病理解剖检查
• 4.2 显微镜检查方法
• 4.3 PCR 检测
• 4.4 通用引物扩增以及质粒的鉴定
• 4.5 附红细胞体的种类及分类
• 4.6 附红细胞体的解离
• 4.7 SDS-PAGE 结果及western blot 结果
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文目录及著作
• 硕士学位论文内容简介及自评