应用RNA干扰技术建立MMP-9基因沉默胃癌细胞克隆

论文摘要

恶性肿瘤的主要特征是浸润和转移,细胞外基质（ECM）和基底膜的降解为关键环节。基质金属蛋白酶-9（MMP-9）作为蛋白水解酶的一种,能降解基底膜和细胞外基质成分,从而促进肿瘤的浸润、转移及间质血管新生。胃癌组织中MMP-9检测结果与临床病理资料对比的研究表明,该酶不仅与胃癌的分化程度、分期、病理类型、转移和预后有关,然而MMP-9基因在转录和翻译水平的抑制作用尤其是RNA干扰对胃癌的影响尚未明了。RNA干扰是由dsRNA介导的同源mRNA降解,从而引起相应基因沉默的一种广泛存在于酵母、真菌、植物、动物体内古老的生物防御机制。1998年后,许多研究小组对RNAi的机制和应用进行了大量的研究。在应用方面主要是利用RNAi技术对线虫、果蝇、植物、动物及病毒的某些基因进行干扰,从而达到基因敲除或抑制病毒复制的目的。本实验目的是应用质粒载体将基质金属蛋白酶-9（MMP-9）特异性siRNA通过脂质体转染胃癌细胞,构建了低分化胃腺癌细胞BGC823的MMP-9基因沉默细胞模型;应用免疫荧光、western blot、明胶酶谱分析等方法验证RNA干扰所得到的基因沉默胃癌细胞株。本实验应用分子克隆技术结合RNA干扰技术在转录和翻译水平对特定基因MMP-9进行抑制,从而对该基因在胃癌浸润、转移中的作用及机制进行探讨。实验关键在于获得较高干扰效果并筛选获得成功转染质粒的细胞克隆。这将为后续的体内外胃癌模型建立提供基础。该RNA干扰模型建立,从分子水平探讨胃癌细胞浸润与基质金属蛋白酶9的关系,在胃癌基因水平研究做了初步探索,结果可能对胃癌的早期诊断、预后判断和基因治疗提供参考。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 1.MMP-9 基因功能的研究进展
• 1.1.MMP-9 基因的生物学特点
• 1.2.MMP-9 基因在恶性肿瘤细胞中表达的研究进展
• 2.RNA 干扰系统在肿瘤基因治疗中的研究进展
• 2.1.RNA 干扰基本原理及研究进展
• 2.2.RNA 干扰在恶性肿瘤实验研究中的应用
• 3. 本论文的思路、目的和意义
• 材料与方法
• 1. 材料
• 1.1 主要仪器
• 1.2 质粒、细胞株
• 1.3 试剂
• 1.4 常用溶液及培养基配置
• 2. 方法
• 2.1 常规细胞生物学方法
• 2.2 常用细胞克隆方法
• 2.3 常用蛋白组学检测实验法
• 结果与分析
• 第一部分 siRNA 片段筛选和克隆
• 1.1 shRNA 的构建
• 1.2 转转染条件的优化
• 1.2.1 DNA 量对转染效率的影响
• 1.2.2 脂质体量对转染效率的影响
• 1.2.3 转染时间对转染效率的影响
• 1.2.4 不同细胞 DNA 质量以及细胞状态对转染效率的影响
• 1.3 针对MMP-9基因的有效shRNA靶序列筛选
• 1.3.1 靶mRNA 表达变化
• 1.3.2 转染MMP-9 特异性shRNA 对胃癌细胞中MMP-9 蛋白表达的影响
• 第二部分 MMP-9基因沉默的BGC823胃癌细胞克隆构建
• 2.1 MMP-9 shRNA 质粒分子克隆
• 2.2 脂质体转染质粒进入胃癌 BGC823 细胞
• 2.3 成功转染shRNA 的胃癌细胞单克隆筛选
• 2.4 蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳分析验证 MMP-9 基因沉默的胃癌细胞克隆
• 讨论
• 1. MMP-9 蛋白与胃癌细胞浸润、转移的关系
• 2. pGenesi 载体介导的稳定 RNAi 系统
• 3. 筛选单克隆细胞的意义
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 综述