论文摘要
研究背景变应性鼻炎是耳鼻咽喉科的常见病之一,其主要症状包括流涕、喷嚏、鼻痒和鼻堵,是特应性个体接触致敏原后由IgE介导的介质（主要是组胺）释放,并有多种免疫活性细胞和细胞因子等参与的鼻粘膜慢性炎症反应性疾病。随着工业的发展和生活环境的改变,变应性鼻炎的发病率近年来有增高的趋势,已成为亟待解决的全球性健康问题。在变应性鼻炎的发病机制中,除了经典的免疫学机制,还牵涉到了神经调节机制;其中,自主神经系统功能紊乱被认为是致病因素之一。研究表明,变应性鼻炎患者伴有胆碱能功能亢进。而临床研究也证实,M受体拮抗剂异丙托溴铵对变应性鼻炎的某些症状具有较好的疗效。目前,国内外已上市的鼻用抗胆碱制剂只有异丙托溴铵;而苯环喹溴铵是我国首次合成的一种新型M受体拮抗剂,属化学一类新药,目前尚无研究报道,为了探明其对变应性鼻炎的治疗效果和作用机理、评价其安全性,特进行了本研究。第一部分苯环喹溴铵的药效学研究:主要实验方法:以OVA致敏大鼠,建立大鼠变应性鼻炎模型;并以TDI致敏豚鼠,建立豚鼠变应性鼻炎模型,观察苯环喹溴铵对两种变应性鼻炎模型的治疗效果（包括行为学评分、鼻分泌物量和病理观察）。同时,建立小鼠耳肿胀、毛细血管通透性亢进模型和豚鼠皮肤致痒模型,观察苯环喹溴铵的抗炎和止痒作用。在上述大鼠变应性鼻炎模型中,以ELISA法检测大鼠血清和鼻分泌物中OVA特异性的IgE;而在豚鼠变应性鼻炎模型中,则以ELISA法检测鼻粘膜中的组胺浓度,放射配基法（RBA）测定豚鼠鼻粘膜中的M受体总密度（[3H]-QNB与鼻粘膜M受体的饱和实验）和3种M受体亚型的密度（PZ、GI、4-DAMP对[3H]-QNB与M受体结合的双位点竞争抑制实验）,观察苯环喹溴铵对豚鼠鼻粘膜中组胺浓度以及M受体总密度和m1、m2、m3亚型受体密度的影响。另以表达m1、m2、m3三种M受体亚型的CHO细胞系,进行单位点竞争抑制实验,探明苯环喹溴铵对此三种M受体亚型的选择性;同时以离体肌条测定苯环喹溴铵的pA2值。主要研究结果:1、苯环喹溴铵的疗效在大鼠和豚鼠变应性鼻炎模型,相对于模型组,苯环喹溴铵能明显缓解动物的流涕、喷嚏、鼻痒等鼻炎症状（P< 0.01）,并能显著减少鼻分泌物（P< 0.01或P< 0.05）,减轻鼻粘膜的病理改变（P< 0.01或P< 0.05）,表明其对变应性鼻炎具有较好的疗效。相对于溶媒对照组,苯环喹溴铵能较好的抑制二甲苯所致的炎症反应（P< 0.01）,降低冰醋酸诱发的毛细血管通透性增加（P< 0.01）,缓解磷酸组胺的致痒作用（P< 0.01）,表明苯环喹溴铵具有较好的抗炎、止痒作用。2、苯环喹溴铵的作用机理2.1与模型组相比,苯环喹溴铵能显著降低致敏大鼠血清和鼻分泌物中的OVA特异性IgE水平（P< 0.01或P< 0.05）;苯环喹溴铵大、中剂量还能显著降低致敏豚鼠鼻粘膜的组胺浓度（P< 0.01）,并显著减少鼻粘膜嗜酸性粒细胞的浸润（P< 0.01）。所以苯环喹溴铵治疗变应性鼻炎的免疫学作用可能就是通过对上述几个环节的调节来实现的。2.2与模型组相比,苯环喹溴铵能明显降低致敏豚鼠鼻粘膜的M受体密度（P< 0.01）,在三种亚型中具体表现为:m1和m3亚型的受体密度明显降低（P< 0.01）,而m2亚型的受体密度却明显升高（P< 0.01）。由于m1和m3亚型受体主要介导粘膜下的腺体分泌,所以这两种亚型受体密度的下降,可以减少腺体的分泌;而m2受体密度的上调,则可增加Ach的再摄取,使Ach释放的负反馈调节增强,从而减少Ach的释放,两种作用对变应性鼻炎的缓解都起到了一定的效果。这可能就是苯环喹溴铵治疗变应性鼻炎的神经调节机制。2.3在m1、m2、m3三种M受体的亚型选择性实验中,PZ对三种细胞的抑制能力为:CHOm1﹥CHOm3﹥CHOm2;GI对三种细胞的抑制能力为:CHOm2﹥CHOm3﹥CHOm1;4-DAMP对三种细胞的抑制能力为:CHOm3﹥CHOm1﹥CHOm2,符合PZ、GI、4-DAMP的药理学特性,所以可以用于药物M受体亚型选择性的鉴定。结果表明,苯环喹溴铵对三种细胞的抑制能力为:CHOm3﹥CHOm1﹥CHOm2,其中苯环喹溴铵对m3和m1受体亚型的选择性接近,而明显高于对m2受体亚型的选择性。2.4在豚鼠离体膀胱肌条实验中,苯环喹溴铵能使Ach的量效曲线平行右移,其pA2值为7.09±0.057（n=6）。第二部分苯环喹溴铵的安全性研究:主要实验方法:苯环喹溴铵经鼻给药,观察其对动物中枢神经系统、呼吸系统、心血管系统以及瞳孔的影响,同时评价其皮肤致敏性、粘膜刺激性和反复经鼻给药的长期毒性。主要研究结果:1、给药后各时间点,苯环喹溴铵在小鼠脑组织中的分布浓度均较低,均在定量下限（0.5405ng/ml）以下,而在血浆中的浓度却相对较高（给药后48h,血浆中的浓度为4.01±0.52ng/ml）,表明苯环喹溴铵对血脑屏障的通透性很低。而苯环喹溴铵对小鼠的自主活动,爬杆运动,学习记忆能力,与溶媒组相比均无明显影响（P﹥0.05）,可能就是由于其难于通过血脑屏障影响中枢的缘故。2、苯环喹溴铵大、中、小剂量鼻粘膜给药后各时间点对麻醉犬的呼吸频率和幅度均无明显影响,与溶媒对照组间无差异（P>0.05）;而苯环喹溴铵大剂量组给药后1、2h和中剂量组给药后2h,小鼠气管的酚红分泌浓度明显少于溶媒对照组（P﹤0.01）。3、苯环喹溴铵大、中、小剂量鼻粘膜给药后5min、10min、15min、30min和1h,麻醉犬平均动脉压与溶媒对照组间无显著差异（P>0.05）;麻醉犬心率、心律、心电图P波电压、PR间期、QRS波群时间、R波电压、ST偏移幅度、T波与QT间期,与溶媒对照组比较均无显著差异（P>0.05）,表明苯环喹溴铵对心脏无明显不良影响。4、苯环喹溴铵高、中、低剂量犬连续经鼻给药6个月。用药期间大剂量组在3个月时的血红蛋白水平、红细胞比积、淋巴细胞百分比、钠离子浓度均有降低,而尿素氮、肌酸肌酶水平和中性粒细胞百分比均有升高,6个月时的体重水平有所降低,凝血时间有所延长,谷丙转氨酶和肌酐水平有所升高;中剂量组6个月时的肌酐水平也有所升高,但停药3周后均可恢复。表明苯环喹溴铵连续经鼻给药6个月无不可逆毒性发生。5、苯环喹溴铵对豚鼠皮肤无致敏性。6、家兔连续经鼻给药一周后,苯环喹溴铵组及其溶媒组未见明显粘膜刺激性发生。7、苯环喹溴各剂量组经鼻给药后,与溶媒对照组相比,对家兔的瞳孔大小均有明显影响（P﹤0.01）,但中、小剂量组在2h后基本可以恢复;各实验组动物给药后各时间点,瞳孔对光反射均为阳性。结论:苯环喹溴铵经鼻给药,对变应性鼻炎具有较好的疗效;疗效的发挥可能是通过对变态反应的免疫和神经调节来实现。苯环喹溴铵具有较高的受体选择性,较好的中枢神经系统、心血管系统、呼吸系统安全性,未见明显的粘膜刺激性与皮肤致敏作用,值得开发应用于临床。