秀丽线虫蛋白质酪氨酸磷酸酶组的生物信息学及ceMTM3生物学功能的研究

论文摘要

蛋白质酪氨酸磷酸酶在细胞信号传导过程中发挥着非常关键的作用,并与多种人类疾病的发生、发展密切相关。对于PTPs生物学功能的研究已经越来越受到人们的重视,而秀丽线虫已经被证明是一个非常优秀的模式生物,可以用来研究PTPs的生物学功能以及相关的信号传导通路。首先,我们应用丰富的数据库资源,从秀丽线虫基因组中搜索得到了所有编码蛋白质酪氨酸磷酸酶的基因,并对这些基因及其编码的蛋白质进行了整理和分析。我们发现,秀丽线虫相对人类及其它物种来说,具有一个非常大的PTP组,包含127个成员,而且经过序列比对发现,秀丽线虫PTPs具有非常高的多样性,其中27个以丝氨酸为活性中心位点的PTPs在其它物种中并未发现。另外,我们对秀丽线虫中具有FYVE结构域的MTM家族酶ceMTM3进行了克隆、表达、抗体制备及生物化学性质的表征,发现了一个新的ceMTM3基因亚型,而且证明ceMTM3是作用于底物磷酸肌醇的D3位点上。将ceMTM3基因进行RNA干扰后,秀丽线虫的运动能力在成虫期以后受到了严重的损害,说明ceMTM3在秀丽线虫肌肉保持中发挥着重要的作用,这为研究人类骨骼肌减少症提供了一个优秀的模型并打下了良好的理论基础。

论文目录

• 内容提要
• 第一篇 秀丽线虫蛋白质酪氨酸磷酸酶组的生物信息学研究
• 第一章 前言
• 第一节 蛋白质酪氨酸磷酸酶家族的组成
• 第二节 人类107 个PTPs的分类
• 第三节 PTPs催化结构域的序列特征
• 第四节 PTPs的结构特征
• 第五节 PTPs与人类疾病
• 第六节 本研究的目的和意义
• 一、研究目的
• 二、研究意义
• 第二章 材料与方法
• 一、从秀丽线虫基因组中搜索蛋白质酪氨酸磷酸酶
• 二、序列分析及结构域的确定
• 三、PTP结构域的序列比对及系统发生学分析
• 四、生物进化树的绘制
• 第三章 结果与讨论
• 第一节 秀丽线虫127 个蛋白质酪氨酸磷酸酶概况
• 一、秀丽线虫PTP超家族成员
• 二、秀丽线虫超家族酶活性位点的特征
• 三、秀丽线虫PTPs在染色体上的定位
• 四、秀丽线虫PTPs的表达情况分析
• 五、秀丽线虫PTPs中的假基因
• 六、秀丽线虫PTP组中的相似序列
• 七、对PTP1B-like cePTPs的活性预测
• 第二节 秀丽线虫PTPs的分类
• 一、秀丽线虫PTP1B-like蛋白质酪氨酸磷酸酶
• 二、秀丽线虫VH1-like双底物特异性磷酸酶
• 三、CDC25 亚家族
• 四、低分子量蛋白质磷酸酶
• 五、EYA亚家族酶
• 第三节 秀丽线虫PTPs的结构特征
• 一、秀丽线虫PTP1B-like PTPs的结构特征
• 二、WSN结构域的序列特点
• 第四节 PTP1B-like PTPs进化规律的初步研究
• 一、有代表性的真核生物物种PTP组的研究
• 二、线虫动物门PTP组
• 三、脊索动物门PTP组
• 四、节肢动物门PTP组
• 五、棘皮动物门PTP组
• 六、原生生物PTP组
• 七、多去氧核糖核酸病毒（polydnavirus）中的PTP组
• 第四章 结论
• 第二篇 应用RNAi技术研究秀丽线虫MTM3 的生物学功能
• 第一章 前言
• 第一节 MTM亚家族蛋白质磷酸酶
• 第二节 RNA干扰
• 一、RNAi的机理
• 二、RNAi的特征
• 三、RNAi的生物学功能
• 四、待解决的问题
• 第三节 秀丽新杆线虫
• 一、秀丽线虫简介
• 二、线虫作为模式生物的优势
• 三、RNAi在线虫中的实现方法
• 第四节 本研究的目的及意义
• 一、研究目的
• 二、研究意义
• 第二章 秀丽线虫MTM3 的分子克隆
• 第一节 实验材料
• 一、菌株及质粒
• 二、试剂
• 三、仪器
• 第二节 实验方法
• 一、基本分子生物学实验方法
• 二、cDNA 末端快速扩增技术（rapid amplification of cDNA ends, RACE）
• 三、引物设计
• 四、秀丽线虫总RNA的提取
• 五、cDNA的合成
• 六、目的片段的扩增
• 七、RACE产物的序列测定
• 八、ceMTM3 全长编码区的克隆
• 九、融合蛋白表达载体的构建和诱导表达
• 第三节 实验结果
• 一、ceMTM3 基因新的亚型的发现
• 二、ceMTM3b cDNA的克隆
• 三、ceMTM3b编码区的全长克隆
• 四、ceMTM3CT克隆载体的构建
• 五、ceMTM3CT表达载体的构建
• 本章小结
• 第三章 ceMTM3 多克隆抗体的制备
• 第一节 实验材料
• 一、试剂及柱料
• 二、缓冲液
• 三、仪器设备
• 第二节 实验方法
• 一、GST-ceMTM3CT融合蛋白的分离纯化
• 二、线虫PRL抗体的制备
• 三、ceMTM3 抗体的纯化
• 第三节 结果与讨论
• 一、GST-ceMTM3CT融合蛋白的分离纯化
• 二、免疫家兔后抗体效价的检测
• 三、多克隆抗体经纯化后抗体效价的检测
• 本章小结
• 第四章 ceMTM3 生物学功能的研究
• 第一节 实验材料
• 一、菌株、线虫和质粒
• 二、缓冲液及培养基
• 三、仪器设备
• 第二节 实验方法
• 一、表达ceMTM3 dsRNA菌株的构建
• 二、线虫的一般培养
• 三、对线虫ceMTM3 基因的干扰
• 四、干扰后对线虫表型的观测
• 五、线虫cPRL基因表达位点的研究
• 六、磷酸酶活性分析
• 七、脂质-膜覆盖分析
• 八、研究线虫ceMTM3 基因在线虫生命周期的表达
• 第三节 结果与讨论
• 一、dsRNA表达载体的构建
• 二、ceMTM3 生物化学性质的表征
• 三、RNAi对ceMTM3 表达的影响
• 四、干扰后线虫表型变化的观测
• 五、ceMTM3 表达分布位点的研究
• 六、ceMTM3 在不同发育阶段线虫中的表达
• 本章小结
• 第五章 结论
• 参考文献
• 攻读博士期间发表的论文
• 致谢
• 中文摘要
• Abstract