胡桃楸活性成分分离解析及抗肿瘤作用的研究

论文摘要

胡桃楸（Juglans mandshurica）为胡桃科、胡桃属植物,俗名核桃楸。《开宝本草》最早记载胡桃楸有清热解毒、敛肺定喘、抑菌镇咳及抗癌之功效。现代研究表明胡桃楸具有较强的抗肿瘤、抗氧化、镇痛、抗炎和抗菌等作用。目前,对于抗肿瘤的研究主要集中于胡桃楸的青果皮,树皮及根部,对其枝叶研究较少,尤其未见胡桃楸叶中单体化合物及其抗肿瘤研究的详细报道。为了阐明胡桃楸叶的抗肿瘤活性成分,论文研究采用活性跟踪分离的方法,从中得到一个具有抗肿瘤作用的新化合物,并从细胞增殖和细胞凋亡角度研究了该化合物的抗肿瘤活性。首先,用活性跟踪分离的方法,对胡桃楸中具有抗肿瘤活性的化学成分进行目标性分离。全程采用肿瘤细胞跟踪筛选,利用有机溶剂萃取、硅胶层析、凝胶层析、减压柱层析及高效液相色谱技术对胡桃楸中抗肿瘤活性组分进行分离纯化,最终得到一个活性单体化合物。其次,利用红外、紫外可见光谱以及核磁共振波谱（包括二维核磁波谱）和高分辨质谱技术,对得到的单体化合物进行结构解析,鉴定为一种新的醌类化合物,命名为对羟基甲氧基苯并双胡桃醌（p-Hydroxymethoxybenzobijuglone,HMBBJ）。最后,研究了新化合物HMBBJ的抗肿瘤活性,并初步探讨了HMBBJ发挥抗肿瘤作用的可能机制。（1）HMBBJ对肿瘤细胞的抗增殖作用。MTT结果显示,HMBBJ可以明显抑制人宫颈癌细胞（HeLa）,人乳腺癌细胞（MCF-7）和人胃癌细胞（BGC823）增殖,对三种细胞的IC50值均小于17μM,且对正常建系细胞——小鼠前脂肪细胞（3T3-L1）损伤较小。HMBBJ对四种细胞的IC50值与阳性对照药羟基喜树碱的较为接近,这表明HMBBJ具有较好的抗肿瘤活性且毒副作用较小;三种肿瘤细胞培养液中乳酸脱氢酶（LDH）的测定结果表明HMBBJ可通过增加细胞膜的通透性使肿瘤细胞活力丧失,从而抑制其生长。（2）HMBBJ对肿瘤细胞的促凋亡作用。通过形态学观察发现,HMBBJ不仅使三种肿瘤细胞的数量明显减少,细胞变圆,细胞折光度下降,并伴有染色质固缩,细胞核呈致密浓染,出现凋亡小体的典型凋亡特征。同时,流式细胞仪的分析也表明了HMBBJ可以有效诱导三种肿瘤细胞凋亡,并可使其细胞周期阻滞于G2/M期。线粒体跨膜电位、细胞内钙离子浓度及凋亡相关的酶（caspase-8,-3）和蛋白（Bcl-2和Bax）的检测结果表明,HMBBJ诱导的三种肿瘤细胞凋亡与线粒体途径有关,对于HeLa细胞和MCF-7细胞,还同时有死亡受体途径的参与;HMBBJ可以使三种肿瘤细胞的线粒体跨膜电位明显减小,caspase-3的活性提高,Bcl-2蛋白含量降低;对于HeLa细胞和MCF-7细胞,HMBBJ诱导的细胞凋亡还伴随着caspase-8活性的提高和细胞内钙离子浓度的升高,且HMBBJ可以使HeLa细胞中的Bax蛋白表达增加。（3）HMBBJ发挥抗肿瘤作用的可能机制。在无细胞体系中,28.9-54.7μM的HMBBJ可以有效抑制DNA拓扑异构酶Ⅰ的活性,这说明DNA拓扑异构酶Ⅰ可能是HMBBJ在较高浓度时发挥抗肿瘤作用的一个有效靶点。总之,新的醌类化合物HMBBJ是胡桃楸中的抗肿瘤活性成分之一,能够有效抑制肿瘤细胞增殖,并主要通过线粒体途径诱导肿瘤细胞凋亡。这些研究为胡桃楸的抗肿瘤药物开发提供重要理论依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 1.抗肿瘤药物及其作用机制研究进展
• 1.1 胡桃楸植物化学成分及生物活性研究概况
• 1.1.1 胡桃楸的植物化学成分
• 1.1.2 胡桃楸的药理活性研究概况
• 1.2 醌类抗肿瘤作用机制研究进展
• 1.2.1 萘醌类化合物抗肿瘤活性研究进展
• 1.2.2 蒽醌类化合物抗肿瘤活性研究进展
• 1.3 抗肿瘤药物的作用机制概论
• 1.3.1 抗肿瘤药物研究概况
• 1.3.2 细胞凋亡与肿瘤治疗
• 1.3.3 DNA拓扑异构酶Ⅰ抑制剂与肿瘤治疗
• 1.3.4 DNA拓扑异构酶Ⅰ抑制剂与细胞凋亡
• 1.4 选题依据及实验方案
• 1.4.1 选题依据
• 1.4.2 实验方案
• 2.胡桃楸中抗肿瘤成分的分离
• 2.1 实验材料及设备
• 2.1.1 药材
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 仪器
• 2.1.4 细胞系
• 2.1.5 溶液配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 细胞培养
• 2.2.2 胡桃楸提取物制备
• 2.2.3 MTT法检测胡桃楸提取物对细胞的抑制率
• 2.2.4 胡桃楸活性部位的提取
• 2.2.5 胡桃楸活性成分的跟踪分离
• 2.2.6 薄层层析检测方法
• 2.2.7 统计学处理
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 胡桃楸各阶段分离产物的活性跟踪检测
• 2.3.2 胡桃楸活性成分的抗增殖作用
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 3.抗肿瘤活性成分HMBBJ的结构解析
• 3.1 实验仪器及方法
• 3.1.1 实验仪器
• 3.1.2 实验方法
• 3.2 化合物HMBBJ的结构解析
• 3.2.1 HMBBJ的理化性质及红外紫外光谱分析
• 3.2.2 HMBBJ分子量及分子式的确定
• 3.2.3 HMBBJ的结构解析
• 3.3 讨论
• 3.4 化合物的结构鉴定数据
• 4.HMBBJ的抗肿瘤作用研究
• 4.1 实验材料及设备
• 4.1.1 试剂
• 4.1.2 仪器
• 4.1.3 细胞株
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 细胞培养
• 4.2.2 HMBBJ溶液的配制
• 4.2.3 MTT法检测HMBBJ及HCPT对四种细胞的抑制率
• 4.2.4 乳酸脱氢酶的测定
• 4.2.5 细胞的形态学观察
• 4.2.6 细胞周期检测
• 4.2.7 Annexin V-PI双染检测细胞凋亡和坏死
• 4.2.8 线粒体膜电位的检测
• 4.2.9 细胞内钙离子含量的测定
• 4.2.10 Caspase-3和caspase-8活性分析
• 4.2.11 Bcl-2和Bax蛋白含量分析
• 4.2.12 蛋白质含量的测定
• 4.2.13 HMBBJ及HCPT对DNA Topo I活力抑制测定试验
• 4.2.14 HMBBJ对pBR322质粒DNA直接作用测定试验
• 4.2.15 溶剂对DNA Topo I活力和对质粒DNA作用影响的测定试验
• 4.2.16 统计学处理
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 HMBBJ的增殖抑制作用
• 50值比较'>4.3.2 HMBBJ和HCPT对三种肿瘤细胞和一种正常细胞的IC₅₀值比较
• 4.3.3 HMBBJ对三种肿瘤细胞LDH漏出率的影响
• 4.3.4 HMBBJ诱导肿瘤细胞凋亡的形态学变化
• 4.3.5 HMBBJ对肿瘤细胞细胞周期的影响
• 4.3.6 HMBBJ诱导肿瘤细胞凋亡率分析
• 4.3.7 HMBBJ对肿瘤细胞线粒体膜电位的影响
• 4.3.8 HMBBJ对肿瘤细胞细胞内钙离子浓度的影响
• 4.3.9 HMBBJ对肿瘤细胞Caspases酶活性的影响
• 4.3.10 HMBBJ对肿瘤细胞Bcl-2和Bax蛋白含量的影响
• 4.3.11 HMBBJ对DNA Topo I活性的抑制作用
• 4.3.12 HCPT对DNA Topo I活性的抑制作用
• 4.3.13 HMBBJ与HCPT对DNA Topo I活性抑制作用比较
• 4.3.14 HMBBJ对pBR322质粒DNA直接作用
• 4.3.15 溶剂对DNA Topo I活性和对质粒DNA作用的影响
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 5.结论与展望
• 5.1 主要结论
• 5.2 研究展望
• 参考文献
• 附录 化合物HMBBJ的波谱数据图
• 攻读博士学位期间发表学术论文情况
• 创新点摘要
• 致谢
• 个人简历