费氏中华根瘤菌WGF03中硫代谢相关基因pdxP的研究

论文摘要

硫是生物体内必不可少的大量生命元素之一,它不仅在氨基酸,蛋白质和脂类的合成及功能形成上发挥重要作用,还参与生物体内许多辅酶的合成作用。对根瘤菌而言,其对宿主的专一性正是由根瘤菌结瘤因子还原性末端的硫化修饰所决定的。在硫酸盐同化途径中,由硫化物（S2-）与O-乙酰丝氨酸（OAS）催化合成的半胱氨酸（Cys）所需的O-乙酰丝氨酸-（巯基）-裂解酶（OASTL）属于5’-磷酸吡哆醛（PLP）依赖型酶家族,而pdxP编码的是5’-磷酸吡哆醇磷酸酶,它的作用是专一性的催化5’-磷酸吡哆醇（PNP）和5’-磷酸吡哆醛（PLP）脱磷酸变为吡哆醇和吡哆醛。通过对苜蓿根瘤菌的研究发现PdxP很可能是调节生物体内PNP和PLP含量的限制性酶。本实验首先利用质粒转座子（pTnMod-RKm’）随机插入到构建了费氏中华根瘤菌WGF03基因组中,构建了5000个突变体,然后通过对不同硫源利用的选择性筛选,得到了20个与硫代谢相关突变体,之后通过基因测序和生物信息学分析,获得了一段基因序列与Sinorhizobium meliloti中编码pyridoxine 5-phosphate phosphatase的pdxP gene在核苷酸水平上有87%的一致性,在氨基酸水平上有88%的相似性本实验利用自杀质粒pK18mob,运用同源单交换的方法构建了费氏中华根瘤菌WGF03 pdxP的非极性突变体WTA和极性突变体WTB。通过测定突变体利用不同硫源的情况,发现突变体在以硫酸盐,亚硫酸盐和硫代硫酸盐作为唯一硫源的生长速度非常缓慢,且长势很差。通过植株实验发现,突变体单株的结瘤数量减少,结瘤时间推迟,竞争结瘤的能力也下降,而植株干重,瘤重和固氮酶活没有显著差异。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 氮源与生物的关系
• 1.2 固氮作用
• 1.3 生物固氮
• 1.3.1 生物固氮的机制
• 1.3.2 生物固氮的意义
• 1.3.3 生物固氮的方式
• 1.4 根瘤菌-豆科植物的共生固氮作用
• 1.4.1 共生固氮的意义
• 1.4.2 根瘤菌的分类
• 1.5 根瘤菌-豆科植物的结瘤作用
• 1.5.1 根瘤形成的过程
• 1.5.2 根瘤的种类
• 1.5.3 根瘤菌与宿主信号交换的机制
• 1.5.4 Nod信号子结构与宿主特异性
• 1.5.5 Nod信号子的识别作用与信号转导
• 1.5.6 固氮调节机制与同化作用
• 1.6 硫元素与生物的关系
• 1.6.1 硫元素对生物的意义
• 1.6.2 硫元素与其他元素代谢的相互作用
• 1.7 硫代谢
• 1.7.1 硫酸盐同化途径
• 1.7.2 结瘤基因与硫代谢的关系
• 1.8 pdxP与根瘤菌硫代谢的关系
• 1.9 本研究课题的目的
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 培养基、培养条件和菌种保存
• 2.2.1 培养基
• 2.2.2 培养条件
• 2.2.3 菌种保存
• 2.3 抗生素
• 2.4 溶液、缓冲液和试剂
• 2.5 琼脂糖凝胶电泳
• 2.6 根瘤菌基因组DNA的提取
• 2.7 质粒DNA的制备
• 2.8 限制性内切酶消化DNA
• 2.9 DNA酶切片段回收
• 2.10 聚合酶链式反应（PCR）体外扩增DNA
• 2.10.1 扩增反应
• 2.10.2 PCR产物的纯化
• 2.11 DNA连接
• 2.12 DNA转化
• 2法制备感受态细胞'>2.12.1 CaCl₂法制备感受态细胞
• 2.12.2 化学转化
• 2.13 三亲本接合
• 2.14 根瘤菌生长曲线的测定
• 2.15 大豆植株实验
• 第三章 克隆5'-磷酸吡哆醇磷酸酶基因（pdxP）
• 3.1 筛选与根瘤菌硫代谢相关的基因
• 3.1.1 构建转座子随机插入突变体
• 3.1.2 用选择培养基筛选随机突变体
• 3.2 测定所选突变体被转座子插入的两侧基因序列
• 3.2.1 克隆转座子插入的两侧序列
• 3.2.2 对筛选基因进行生物信息学分析
• 第四章 pdxP基因的突变及突变体的研究
• 4.1 pdxP基因突变体的构建
• 4.1.1 扩增pdxP基因的部分片段
• 4.1.2 利用pK18mob质粒同源单交换构建重组质粒
• 4.1.3 pK18-bpdxp重组质粒的验证
• 4.1.4 构建pdxP基因的突变体
• 4.2 构建互补体
• 4.3 pdxP基因突变体及互补体的功能验证
• 4.4 植株实验
• 4.4.1 大豆植株的结瘤时间测定
• 3.4.2 共生固氮效应检测
• 第五章 总结与讨论
• 5.1 总结
• 5.2 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的论文