人呼吸道合胞病毒减毒疫苗侯选株的筛选

论文摘要

人类呼吸道合胞病毒（human respiratory syncytial virus,HRSV）是各年龄组下呼吸道感染的主要病毒病原体之一,尤见于婴幼儿、老年人及免疫缺陷病人等急性呼吸道感染住院者。世界卫生组织已将研究RSV疫苗列为全球疫苗计划的优先发展项目之一。其中针对RSV的减毒活疫苗最具前景,因此我们计划通过低温连续传代加化学诱变剂诱导突变的方式使RSV毒力降低,然后用蚀斑法克隆分离单一纯系的病毒株,用敏感动物体内接种法来检测RSV毒力及免疫原性改变的情况,最终期望获得在动物体内毒力很低但能有效诱导高水平免疫应答的减毒株作为疫苗候选株。实验从研究内容上可分为针对RSV的基础研究及低温传代减毒疫苗侯选株筛选两部分。第一部分针对RSV的一些基础研究此部分对RSV的一些基本特征进行了探索。首先探讨了不同细胞基质对RSV病毒生长情况的影响。在相同培养条件下,用单层KMB17细胞、Vero细胞、Hep-2细胞及Hela细胞培养原代RSV,观察并记录病毒引起细胞病变的时间、病变的特点,检测培养物的感染性滴度,比较4种细胞基质下RSV生长繁殖的特点。结果显示用KMB17细胞培养RSV时,于第6天开始出现细胞病变,第12天细胞病变面积超过细胞总面积的75%,观察不到明显的合胞体病变特征,感染性滴度达6.13 lg CCID50/ml;用Vero细胞培养RSV时,于第3天开始出现细胞病变,第8天细胞病变面积超过75%,可观察到明显的合胞体病变特征,感染性滴度达6.83 lg CCID50/ml;用Hep-2细胞及Hela细胞培养RSV时,于第5天开始出现细胞病变,第9天细胞病变面积超过75%,无明显的合胞体病变特征,感染性滴度达6.83 lg CCID50/ml。由此可知4种细胞基质中KMB17细胞对RSV相对不敏感;而Vero细胞对RSV较其它3种细胞敏感,在短时间内细胞可出现明显病变,并达到较高滴度;Hep-2细胞及Hela细胞培养RSV的敏感性相近,较Vero细胞稍弱。由于病毒在体外培养过程中,吸附时间及维持液的pH值可能对病毒的生长产生较大影响。我们在37℃下将RSV吸附不同时间进行培养,观察吸附时间对病毒致细胞病变的影响。实验证明RSV经37℃吸附0分钟、30分钟、60分钟、90分钟后接种,对引起4种细胞病变的时间并没产生明显影响。另外配制pH6.4、pH6.6、pH6.8、pH7.0、pH7.2、pH7.4、pH7.6的细胞维持液用于培养RSV,比较在不同pH环境下病毒生长所受的影响。可明显观察到,在一定范围内pH越高出现病变的时间越短;此外,当pH值高于7.0时,引起的细胞病变形态以细胞圆缩死亡为主,而pH低于7.0的环境下可观察到较多合胞体的病变现象;同时发现,RSV在pH7.2的维持液环境中生长,可获得最高的感染性滴度,达6.63lg CCID50/ml,说明pH7.2左右的维持液较适RSV的生长。研究除了用普通光学显微镜观察细胞病变的方法来检测RSV,还尝试了电镜切片、间接免疫荧光法来检测RSV。实验中取已出现细胞病变的KMB17细胞和Vero细胞制成电镜切片,观察细胞在电子显微镜下的病变情况及病毒的存在与否,从照片上可看到RSV致两种细胞病变的特点及许多类似病毒的颗粒。用间接免疫荧光法检测病毒抗原,从照片上可看出在不同时段RSV在KMB17细胞、Vero细胞和Hela细胞上分布的情况,其中Vero细胞上可见到较多RSV对应的绿色荧光。我们对RSV的动物模型做了初步探索。先是将原代RSV通过注射途径接种到小鼠及其乳鼠的脑内,培养观察它们的生长情况,到第14天时处死,解剖取脑和肺组织做病理切片（HE染色）。结果所有经脑内接种原代RSV的鼠饲养至第14天时全部存活,无明显生长异常的现象,病理切片上也未见病理学改变。表明小鼠脑组织不是RSV侵蚀的主要靶器官,不适合研究RSV毒力强弱。后通过滴鼻途径接种原代RSV到豚鼠鼻腔,除观察生长情况及病理切片外,还检测了豚鼠血清中和抗体的效价,并用细胞培养法分离豚鼠肺部的RSV。结果豚鼠经接种RSV后,在第7天、14天处死时体重明显低于正常对照组,呼吸较正常对照组急促,病理切片显示其已经患有严重的间质性肺炎;14天时豚鼠血清中可检测到1:4稀释的抗体效价;而肺部组织可分离出低感染性滴度的RSV。所有结果显示豚鼠可作为研究RSV毒力强弱的一种动物模型。第二部分低温传代减毒疫苗侯选株的筛选本研究依据冷传代培养病毒可以积累病毒株的温度敏感效应的原理（仅一部分病毒有此特点）,通过接种RSV病毒至人胚肺KMB17细胞上,在低温下进行持续传代培养。用T特征实验（检测病毒在允许温度和限制温度下的滴度差值）检测各代病毒的温度敏感特征。RSV在KMB17细胞上于37℃下已经扩增了5代,病毒感染性滴度在6.0lgCCID50/ml左右,在后续实验中这几代病毒可作为原代病毒对照使用;到目前为止,RSV在KMB17细胞上于32℃下已连续传代至第20代,各代病毒病变的时间及收获时间变动都较大,病毒感染性滴度仍是围绕6.0 lg CCID50/ml上下波动,温度敏感实验中RSV在允许温度和限制温度下的滴度差值最大仅为1.5lg CCID50/ml,未发现明显的温度敏感性特征。取低温传代第6代和第11代的RSV,用第一部分中接种原始代次RSV相同的方法经滴鼻接种豚鼠,检测毒力变化情况。结果显示接种第6代和第11代病毒的豚鼠与阴性对照组相比,体重一致,呼吸正常,这两个指标均未发现明显差异。但这两代病毒同样引起了豚鼠肺部强烈的间质性肺炎,从病理损伤角度看,接种原代、第6代及第11代RSV的豚鼠在第7天时炎症细胞均以呈结节状和大片状浸润为主,似乎病变更严重,在第14天炎症细胞呈弥漫浸润,接种这3代病毒的豚鼠的肺组织切片并未显示出明显不同。其中接种第11代RSV的一只豚鼠与其它相比,出血较明显、肺泡结构呈片状坏死,并可见小部分肺泡代偿性气肿,这是否由动物个体差异所致,还是病毒毒力所致尚不能确定。接种6代病毒的豚鼠14天时血清中可检测到1:8的中和抗体效价,而接种11代病毒的豚鼠14天时血清中可检测到1:4稀释的抗体效价,可见第6代病毒在一定程度上更有效地刺激了豚鼠的体液免疫应答。从它们肺组织中分离出与原始代次一致、4.0 lg CCID50/ml左右低感染性滴度的RSV。以上结果提示,低温传代到第11代时,尚没有明显的减毒特征,需要进一步传代。综上所述,本研究探讨了RSV的一些最基本的特征,为优化病毒培养条件,研制理想的病毒疫苗株积累了初步的实验资料。另外对RSV进行低温传代,并研究其毒力变化情况。从结果看来,经过20代的冷传代,病毒在KMB17细胞上的生长时程变动较大,还不具有温度敏感特征。接种第6代和第11代病毒的豚鼠虽体重不再减轻,但仍患有强烈的间质性肺炎,说明RSV的毒力还需进一步降低。与国际上一些比较好的RSV减毒活疫苗候选株的研制过程相比,还需对RSV增加低温传代次数,并且在后期还要介入化学诱变剂加速其突变,经蚀斑法克隆分离出具有明显温度敏感特征的毒株,这样才能获得理想的减毒活疫苗候选株。因此,本研究在研制减毒活疫苗的整个计划中仅迈出了一小步,今后还有很多工作有待去完成。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 实验材料和方法
• 结果与分析
• 第一部分 对RSV的一些基础研究
• 第二部分 温传代减毒疫苗侯选株的筛选
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 论文综述
• 附录
• 致谢
• 研究生简历