银杏抗菌肽基因Gnk2-1转化甜瓜和西瓜的研究

论文摘要

甜瓜（Cucumis melo L.）和西瓜（Citrullus L.）均属葫芦科植物,是经济价值很高的水果,在世界范围内分布广泛,种类繁多,栽培面积广大。然而,在甜瓜和西瓜生长发育过程中,常会遭到病虫害影响,特别是枯萎病和炭疽病,严重影响了甜瓜和西瓜的产量及品质。通过常规育种方法已培育出许多优良品种,但对某些性状的改良较为困难,利用基因工程对甜瓜和西瓜进行改良已经成为一种直接有效的手段,然而高效组织培养和植株再生技术是转基因技术的先决条件。从银杏种仁中提取出来的抗菌肽蛋白对瓜类尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、炭疽菌（Colletotrichum orbiculare）等真菌有较强的抑制作用。本试验较系统地研究了甜瓜和西瓜子叶的高效遗传转化体系,建立适合甜瓜和西瓜快速、高效繁殖的再生和遗传转化系统,然后利用农杆菌介导法将银杏抗菌肽基因Gnk2-1导入甜瓜和西瓜中进行表达,为今后甜瓜和西瓜品质改良和抗性增强等基因工程的研究奠定基础。主要的研究结果如下:1.本试验建立了甜瓜子叶高效再生体系。以厚皮甜瓜FY1、HY2子叶为试材,研究不同激素组合和配比对甜瓜再生的影响。研究结果表明:相同条件下FY1子叶再生率高于HY2子叶再生率,其子叶最佳愈伤组织及不定芽诱导培养基为MS+6-BA2.0mg·L-1+ IAA0.1mg·L-1,出芽率达95%以上;最佳芽伸长培养基为MS+KT0.2mg·L-1;最佳生根培养基为1/2MS+IAA0.1mg·L-1。2.建立了西瓜子叶高效再生体系。以西瓜品种134-2标、京父-2子叶为材料,研究不同激素组合和配比对西瓜再生的影响。其子叶高效再生体系建立的研究结果表明:品种134-2标西瓜子叶不定芽诱导的最佳培养基为MS+6-BA2.0mg·L-1+IAA0.2mg·L-1,出芽率可达96%,比京父-2子叶出芽率高;芽伸长最佳培养基为MS+KT0.2mg·L-1;最佳生根培养基为1/2MS+IAA0.1 mg·L-1。3.优化甜瓜和西瓜遗传转化体系。以甜瓜FY1和西瓜134-2标子叶为外植体,对卡那霉素的浓度进行筛选,卡那霉素敏感性试验结果表明卡那霉素对甜瓜和西瓜外植体的生长和分化有很强的抑制作用,适宜的筛选压力为100mg·L-1。将子叶预培养2d,在菌液浓度OD600值为0.5左右时,侵染外植体10min左右,共培养3d,转化效率最高。乙酰丁香酮（AS）对甜瓜和西瓜的转化效率影响较小。4.采用农杆菌介导法将银杏抗菌肽基因Gnk2-1转入甜瓜和西瓜,经PCR初步鉴定获得了1株阳性转基因甜瓜植株,对转基因植株离体叶片进行接菌试验,植株对枯萎病的抗性有所增强,发病迟缓。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 甜瓜和西瓜种质资源
• 1.1.1 甜瓜和西瓜种质资源现状
• 1.1.2 甜瓜和西瓜种质资源鉴定
• 1.2 瓜类枯萎病
• 1.2.1 瓜类枯萎病病原研究
• 1.2.2 瓜类枯萎病致病机理研究
• 1.2.3 瓜类枯萎病抗性机理研究
• 1.3 抗菌肽的研究进展
• 1.3.1 抗菌肽的名称及来源
• 1.3.2 抗菌肽的分类
• 1.3.3 抗菌肽的特点
• 1.3.4 抗菌肽的抑菌机理
• 1.3.5 抗菌肽的应用现状及存在问题
• 1.4 植物转基因研究进展
• 1.4.1 瓜类再生体系建立的研究现状
• 1.4.2 遗传转化的方法
• 1.5 研究目的与意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株与质粒
• 2.1.3 生化试剂
• 2.1.4 培养基及试剂的配制方法
• 2.1.5 仪器设备
• 2.1.6 PCR 引物
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 甜瓜和西瓜再生体系的建立
• 2.2.2 甜瓜和西瓜的遗传转化
• 2.2.3 质粒的提取
• 2.2.4 农杆菌介导法转化甜瓜和西瓜
• 2.2.5 甜瓜和西瓜转化植株的PCR 检测
• 2.2.6 转基因甜瓜和西瓜的抗病检测
• 第三章 结果与分析
• 3.1 甜瓜和西瓜离体再生体系的建立
• 3.1.1 不同浓度NaClO 对种子发芽的影响
• 3.1.2 不同激素配比对子叶愈伤组织诱导及不定芽分化的影响
• 3.1.3 不同激素配比对不定芽伸长及生根的影响
• 3.2 卡那霉素浓度的确定
• 3.3 农杆菌质粒提取结果
• 3.4 抗菌肽基因Gnk2-1 转化甜瓜和西瓜的结果
• 3.4.1 预培养对遗传转化的影响
• 3.4.2 菌液浓度对抗性芽分化率的影响
• 3.4.3 乙酰丁香酮对抗性芽出芽率的影响
• 3.4.4 菌液侵染时间对抗性芽分化率的影响
• 3.4.5 共培养时间对抗性芽出芽率的影响
• 3.5 转化的甜瓜和西瓜植株PCR 检测结果
• 3.6 转基因甜瓜的抗枯萎病分析
• 第四章 讨论
• 4.1 甜瓜子叶再生体系的建立
• 4.2 西瓜子叶再生体系的建立
• 4.3 农杆菌介导甜瓜和西瓜遗传转化体系的优化
• 第五章 结论
• 参考文献
• 缩略词
• 致谢
• 作者简介