AcrAB外输泵介导的鸡沙门氏菌耐药性研究

论文摘要

沙门氏菌是医学和兽医学临床感染中最常见的病原菌之一。鸡沙门氏菌是危害我国养禽业健康发展的重要病原菌之一。目前主要使用抗菌药物对该病进行预防和治疗。氟喹诺酮类药物为一类化学合成的广谱、高效、低毒的抗菌药物。随着该类药物的长期和不当使用,其耐药性也随之广泛产生,且耐药率逐年增高。耐药性的产生导致预防和治疗失败,给养殖业带来巨大经济损失。研究表明,鸡沙门氏菌对各种抗菌药物产生耐药性与主动外输系统（外输泵）密切相关。其中AcrAB-TolC外输泵是最主要外输泵,包括药物质子转运子AcrB、周质融合蛋白AcrA和外膜通道蛋白TolC。acrA基因和acrB基因由一个操纵子调控,AcrAB在机能上是统一的,因此,其活动性基本可以反映整个外输泵的活动性。本试验采用试管二倍稀释法通过体外诱导试验,获得对氟喹诺酮类药物环丙沙星不同水平的5株鸡沙门氏菌耐药菌株(分别为16×MIC、32×MIC、64×MIC、128×MIC、256×MIC,MIC为0.5μg·mL-1)。采用Kirby-Bauer纸片法测定上述耐药菌株对10种抗菌药物的敏感性,试验结果表明,5株耐药菌株均为多重耐药菌株,对氟喹诺酮类、四环素、复方磺胺的耐药率均为100%;128×MIC、256×MIC耐药菌株对氨苄西林和头孢唑啉也表现为耐药;但诱导的耐药菌株对卡那霉素,庆大霉素等仍敏感。从以上结果可见,鸡沙门氏菌对多数抗菌药物的耐药率都较高;且氟喹诺酮类药物存在交叉耐药现象。以氰氯苯腙（CCCP）作为能量抑制剂,使菌株处在低能状态,用紫外分光光度法检测它们在能量正常及抑制状态下对氟喹诺酮类药物环丙沙星摄取的速率。结果显示,当无CCCP时,耐药菌株菌体内环丙沙星浓度低于敏感株;而当有CCCP存在时,菌体内环丙沙星浓度随摄取时间而递增,与无CCCP存在时相比,保持明显高的稳态浓度;而质控菌株C79-13,由于外输泵的作用不占主导,所以,不论有无CCCP存在,菌体内环丙沙星浓度随摄取时间而递增,且保持较耐药菌株明显高的稳态浓度。初步证明耐药菌株存在外输泵机制。Girud等人研究表明,沙门氏菌存在由AcrAB外输泵介导的耐药机制,外输泵的活动性与耐药性水平有一定的相关性。本试验16×MIC、64×MIC、128×MIC耐药菌株进行acrA基因的克隆及序列分析,发现与质控菌株相比,16×MIC耐药菌株有一处发生氨基酸残基取代,即M-40→T（Met→Thr）;64×MIC耐药菌株有一处发生氨基酸残基取代,即R-131→C（Arg→Cys）;128×MIC耐药菌株没发生取代。研究提示了鸡沙门氏菌acrA基因突变并不是其产生耐药性的主要原因。为了进一步探讨鸡沙门氏菌对氟喹诺酮类药物的耐药性,研究AcrAB外输泵介导的耐药机制,本试验应用竞争性RT-PCR技术对AcrAB外输泵表达的mRNA进行了定量检测,进而对耐药菌株外输泵的活动进行分析。试验结果表明,与质控菌株相比,5株诱导耐药菌株acrA基因和acrB基因mRNA表达量都有显著提高,且随着耐药水平的增加,acrA基因和acrB基因mRNA表达量呈正相关。这表明,高水平耐药性与AcrAB的过度表达之间有较好的相关性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 病原微生物耐药分子机制研究进展
• 1.1.1 遗传机制
• 1.1.2 生化机制
• 1.2 病原微生物对氟喹诺酮类药物的耐药机制研究进展
• 1.2.1 DNA 旋转酶和拓扑异构酶IV
• 1.2.2 药物主动外输系统（Efflux System）
• 1.2.3 膜通透性降低
• 1.3 氟喹诺酮类药物耐药性的抑制
• 1.4 定量PCR 技术
• 1.5 试验的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 药品
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 分子量标准参照物
• 2.1.5 酶和试剂盒
• 2.1.6 克隆载体
• 2.1.7 主要仪器设备
• 2.1.8 溶液及培养基的制备
• 2.1.9 细菌生化微量鉴定管
• 2.1.10 鸡沙门氏菌属多价诊断血清
• 2.2 方法
• 2.2.1 鸡沙门氏菌耐药菌株的体外诱导及鉴定
• 2.2.2 鸡沙门氏菌耐药菌株的药敏试验
• 2.2.3 不同耐药水平鸡沙门氏菌株对环丙沙星的摄取试验
• 2.2.4 不同耐药水平鸡沙门氏菌acrA 基因的克隆及测序
• 2.2.5 不同耐药水平鸡沙门氏菌acrA 基因转录水平的检测
• 2.2.6 不同耐药水平鸡沙门氏菌acrB 基因转录水平的检测
• 3 结果与分析
• 3.1 鸡沙门氏菌耐药菌株的体外诱导及鉴定
• 3.1.1 环丙沙星的MIC 测定
• 3.1.2 耐药菌株的体外诱导
• 3.1.3 生化鉴定结果
• 3.1.4 药敏试验结果
• 3.2 不同耐药水平鸡沙门氏菌株对环丙沙星的摄取
• 3.2.1 标准曲线的制备
• 3.2.2 C79-13 对环丙沙星的摄取
• 3.2.3 16×MIC 耐药菌株对环丙沙星的摄取
• 3.2.4 32×MIC 耐药菌株对环丙沙星的摄取
• 3.2.5 64×MIC 耐药菌株对环丙沙星的摄取
• 3.2.6 128×MIC 耐药菌株对环丙沙星的摄取
• 3.2.7 256×MIC 耐药菌株对环丙沙星的摄取
• 3.3 不同耐药水平鸡沙门氏菌ACRA 基因的测序及其转录水平的检测结果
• 3.3.1 鸡沙门氏菌基因组提取结果
• 3.3.2 鸡沙门氏菌acrA 基因扩增结果
• 3.3.3 PCR 产物的克隆及阳性克隆的筛选
• 3.3.4 重组质粒鉴定结果
• 3.3.5 菌株C79-13 和16×MIC、32×MIC、64×MIC、128×MIC、256×MIC 耐药菌株测序结果及分析
• 3.3.6 标准曲线的制备
• 3.3.7 各菌株acrA 基因mRNA 水平定量结果
• 3.4 不同耐药水平鸡沙门氏菌ACRB 基因转录水平的检测结果
• 3.4.1 标准曲线的制备
• 3.4.2 各菌株acrB 基因mRNA 水平定量结果
• 4 讨论
• 4.1 沙门氏菌的耐药现状
• 4.2 耐药鸡沙门氏菌的诱导
• 4.3 可能存在的耐药机制
• 4.4 不同耐药水平鸡沙门氏菌株对环丙沙星的摄取
• 4.5 不同耐药水平鸡沙门氏菌ACRA 基因核苷酸及氨基酸序列分析
• 4.6 竞争性RT-PCR 方法在定量检测中的应用
• 4.7 不同耐药水平鸡沙门氏菌ACRAB 基因转录水平的检测
• 4.8 细菌耐药机制研究中存在的问题
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附图
• 攻读硕士期间发表和接收的论文