论文摘要
Sirtl和ATGL在脂肪代谢中发挥着重要的作用。本研究在克隆猪Sirtl （pSirtl）和猪ATGL （pATGL）基因全长cDNA序列的基础上,利用实时荧光定量PCR、RNA干扰（RNAi）和免疫组化等技术分别研究了pSirtl和猪脂肪代谢关键功能基因pATGL表达的组织特异性、表达规律及品种差异,探讨了pSirtl对脂肪代谢关键功能基因表达的影响及其调控脂肪代谢的机理；并进一步研究了TNF-α和Insulin对pSirtl基因表达的影响。主要研究结果如下：1.pSirtl和pATGL基因全长cDNA序列克隆与序列分析通过RACE技术,克隆得到pSirtl和pATGL全长cDNA序列,pSirtl基因全长cDNA序列有4024 bp（GenBank登录号EU030283）,其中包括15 bp 5’非编码区（5’-untranslated region,5’-UTRs）、2226 bp编码区（coding region, CDs）和1780 bp的3’非编码区（3’-UTR）,编码区翻译742个氨基酸（GenBank登录号ABS29571）,分子量80.9 kDa,含有Sirtl蛋白家族的保守核心结构域；BLAST结果表明,pSirtl氨基酸序列序列与人、狗、牛、鼠同源性分别达到87%,92%,91%和82%。pATGL全长cDNA序列1958 bp （GenBank登录号EF583921）,其中包括33 bp的5’-UTRs、1641 bp CDs和464 bp的3’-UTR,编码区翻译486个氨基酸（GenBank登录号ABS58651）,分子量53.2 kDa,含有一个Patatin蛋白保守序列。BLAST结果表明,pATGL氨基酸序列与牛、小鼠、大鼠、狗、人的同源性达到87%、84%、83%、81%、80%。2. pSirtl和pATGL基因表达组织特异性、表达规律及品种差异研究组织特异性研究结果表明,pSirtl mRNA水平在脑中表达量最高,在皮下脂肪中次之；pATGL在皮下脂肪中表达量最高。不同生长阶段表达规律研究结果表明,在皮下脂肪中,pSirtl和pATGL基因表达随着体重的增加而呈增加的趋势；在腹脂和肠脂中,pSirtl和pATGL的表达规律不明显。品种差异研究结果表明,在脂肪组织（皮下脂肪）中,金华猪pSirtl和pATGL基因表达量显著低于长白猪,且与脂肪率成反比（金华猪脂肪率显著高于长白猪）；在肌肉组织（背最长肌）中,金华猪pSirtl和pATGL的表达量显著高于长白猪,pSirtl和pATGL基因表达与肌内脂肪含量成正相关（金华猪肌内脂肪显著高于长白猪）。揭示,pSirtl和pATGL的表达与猪的脂肪代谢和肌内脂肪沉积密切相关,且可能发挥着重要的作用。3.pSirtl对猪脂肪代谢关键功能基因表达的影响及其调控机制研究通过猪前体脂肪细胞体外培养模型的建立,利用RNAi技术和pSirtl的抑制剂烟酰胺（NAM）及激动剂白藜芦醇（RES）研究了pSirtl对脂肪代谢的影响及分子机理；并进一步通过RNAi技术研究了pSirtl对脂肪代谢相关功能基因表达的影响及调控脂肪分解的分子机制。研究结果表明：猪脂肪细胞中,pSirt1和pATGL的基因表达随着细胞的分化而逐渐升高,分别在第10 d和8d时表达量最高。pSirtl的抑制剂NAM抑制pSirtl基因表达后,显著下调pATGL和HSL基因的mRNA水平；同时促进了猪脂肪细胞内脂滴沉积,降低了培养基中甘油含量。用pSirtl激动剂RES激活pSirtl基因表达后,显著提高pATGL和HSL基因表达;同时显著抑制了猪脂肪细胞内脂滴沉积,增加培养基中甘油含量。表明,pSirtl可影响pATGL和HSL基因的表达,直接影响脂肪分解。筛选出了pSirtl和pATGL基因的有效siRNA表达载体RS3和RA1,经干扰条件优化后的干扰效果分别达到70%和60%左右。转染pSirtl-siRNA干扰pSirtl基因表达后,显著降低了pATGL和HSL基因的表达。RES50与pSirtl-siRNA协同作用研究结果也进一步表明,pSirtl能正调控脂肪分解关键酶pATGL和HSL基因的表达。同时研究还发现,NAM抑制pSirtl基因表达后,能显著提高PPARy基因的表达,RES激活pSirtl基因表达后能显著抑制PPARy基因表达,干扰pSirtl后也能够提高PPARy基因的表达。上述结果揭示,pSirtl可通过正调控pATGL和HSL基因表达,进而降低脂滴沉积、促进脂肪分解；在此过程中,PPARγ可能发挥重要功能。4.TNF-α和Insulin对pSirtl基因表达调控研究研究结果表明,不同浓度TNF-α（1,12.5,25,50,100 ng/ml）处理猪脂肪细胞24h和在25ng/ml的TNF-a浓度下处理不同时间（12,24,36,48 h）后,显著降低Sirtl基因表达和培养基中甘油水平；不同浓度Insulin （10,50,100,1000 nM）处理猪脂肪细胞24h和在50 nmol/L的Insulin浓度下处理不同时间（24,36,48）后,也均能显著降低pSirtl基因的表达和培养基中甘油含量。揭示,一定浓度的TNF-α和Insulin处理脂肪细胞一定时间后,可以抑制pSirt1基因表达和脂肪细胞中的脂滴的分解。同时研究还发现,TNF-α和Insulin处理猪脂肪细胞后也均能显著降低pATGL和HSL基因的表达。这进一步证实pSirt1调控脂肪分解可能是通过调控脂肪代谢关键酶pATGL和HSL基因表达实现的。Insulin和pSirt1-siRNA协同处理研究结果表明,Insulin+pSirt 1-siRNA处理组显著抑制pSirt1基因表达,同时显著下调pATGL和HSL基因表达；提示：Insulin和pSirt1-siRNA能协同抑制pSirt1基因表达,下调脂肪动员关键基因pATGL和HSL的表达。