参与拟南芥叶绿体蛋白周转的DEG蛋白酶（DEG2，DEG9）及核糖体蛋白PSRP-4的功能研究

论文摘要

叶绿体是真核生物光合作用的场所,光系统Ⅱ（PSⅡ）是定位于类囊体膜上的极为重要的色素蛋白复合物,它催化光驱动的水裂解并释放氧和质子。因此,PSⅡ对环境胁迫非常敏感,尤其反应中心的中D1蛋白质最易受环境的胁迫而破坏。被破坏的蛋白质随即被降解并由新合成的蛋白质替换。通过这种周转来保持胁迫条件下D1蛋白的稳定及PSⅡ的功能。已有研究表明,叶绿体内有200多种蛋白酶,然而这些蛋白酶中有哪些参与了D1蛋白的周转以及其作用的机制目前仍不清楚。其中,体外实验证明定位于叶绿体的类囊体膜上DEG2蛋白酶能够对光损伤D1蛋白的初步剪切。然而,在拟南芥deg2突变体中光损伤D1蛋白的降解未受影响。因此推测有其他蛋白酶的共同参与D1蛋白的剪切。通过序列比对,在DEG蛋白酶家族中Deg2与Deg9基因的同源性最高。因此本研究主要阐述这两个蛋白在D1周转过程中的协同作用机制。首先我们从SALK拟南芥突变体库中定购到Deg2和Deg9基因的T-DNA插入突变体,并通过杂交筛选到Deg2和Deg9基因缺失的。利用deg2deg9双突变体研究表明：在正常光照条件下,与对照野生型相比,deg2deg9双突变体Fv/Fm（PSⅡ最大光化学效率）没有明显区别,然而,在高光胁迫条件下,Fv/Fm在突变体中显著降低。同时,利用D1蛋白特异性抗体蛋白免疫印记实验证实,光损伤D1蛋白降解速度deg2deg9双突变体明显减慢,然而,其它的PSⅡ反应中心蛋白的水平在高光条件下则保持相对稳定。进一步利用双分子荧光互补技术（BIFC）证实了DEG2和DEG9两个蛋白酶在体内是相互作用的。从我们的研究结果可以推测DEG2和DEG9蛋白酶在PSⅡ反应中心D1蛋白的降解过程及保护其免受光抑制方面起到了特异性的作用。叶绿体蛋白由核基因和叶绿体基因共同编码完成,完整的叶绿体核糖体是由59个蛋白和23S、16S、5S/4.5S rRNA组成,尽管对核糖体蛋白结构和功能方面已经进行了大量研究,但是所涉及的核糖体蛋白,特别是细胞器核糖体蛋白仍比较少。叶绿体核糖体有6个质体特异蛋白（PSRP-1至6）,其中PSRP-4为小的核糖体碱性蛋白,与大肠杆菌及光合细菌的核糖体均无同源性,可能在维持核糖体小亚基晶体结构方面有特殊作用。研究拟南芥中这些由核基因编码的特异蛋白以及它们的作用机制有助于我们进一步认识高等植物核糖体在叶绿体蛋白周转中的功能以及其可能的分子调控机理。在本研究中,我们采用RNAi技术构建了Psrp-4基因突变体。利用psrp-4突变体进行了初步研究,结果表明,在正常条件下和高光条件下,发现psrp-4突变体与野生型生长速度以及Fv/Fm无明显差异。蛋白免疫印记实验表明,D1蛋白周转也没有受到明显影响。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 缩写说明
• 第一章 文献综述
• 1.1 叶绿体是光合作用的主要场所
• 1.2 光系统Ⅱ（photosystemⅡ—-PSⅡ）的结构及其功能
• 1.3 叶绿体中DEG蛋白酶和叶绿体核糖体蛋白的研究进展
• 1.4 光合作用突变体和RNAi技术在植物基因功能研究中的作用
• 1.5 研究的目的和意义
• 第二章 拟南芥DEG2和DEG9蛋白酶突变体的筛选及功能研究
• 2.1 突变体的筛选
• 2.2 双突变体的获得
• 2.3 拟南芥光合作用生理生化测定
• 2.4 光抑制和光恢复
• 2.5 实验验证DEG2和DEG9的相互关系
• 2.6 结果与分析
• 2.7 小结
• 第三章 拟南芥Psrp-4基因RNAi突变体构建及其初步生理生化研究
• 3.1 试剂与实验材料
• 3.2 实验方法
• 3.3 结果与分析
• 3.4 psrp-4突变体光合作用生理生化测定
• 3.5 小结
• 第四章 全文讨论
• 4.1 参与叶绿体蛋白周转的DEG蛋白酶的功能研究
• 4.2 参与叶绿体蛋白周转的PSRP-4的功能研究
• 参考文献
• 致谢
• 硕士期间发表的文章
• 学位论文评阅及答辩情况表