利用滚环放大技术及共振光散射检测DNA及其突变的研究

论文摘要

滚环放大（rolling circle amplification, RCA）是新近发展起来的一种恒温核酸扩增方法。该技术是借鉴噬菌体DNA分子滚环式的复制方式建立起的核酸扩增技术。这种方法可以直接扩增DNA,实现对靶核酸的信号放大,取得核酸分析的高灵敏度,因此在核酸检测中具有很大的应用价值和潜力。在本文中,我们利用锁式探针在连接反应中的单碱基识别的特异性和滚环放大技术对目标DNA进行检测,同时研究了由于单碱基突变所形成的单核苷酸多态性。锁式探针是一段线性DNA,它可以与另一段具有特殊序列的DNA发生识别作用,弯曲成环状结构。只有能够发生连接反应的锁式探针才可发生滚环放大反应。放大后,延伸产物与标记在金纳米粒子上的DNA进行杂交,通过检测其共振光散射（resonance light-scattering,RLS）强度来检测目标DNA的含量。该方法在放大反应后不需分离,得到的共振光散射强度与目标DNA浓度在0.1 nmol/L-2.0 nmol/L范围内呈良好线性关系,检出限为0.077 nmol/L。在RCA反应过程中会产生大量的碱基延伸,当dNTPs结合到模板的同时释放出等量的焦磷酸（PPi）,而焦磷酸可以降解为磷酸,所以可以通过检测溶液中磷酸的含量间接检测DNA。本文第三部分中,我们建立了一种测定微量磷酸的共振光散射分析新方法。研究发现在H2SO4介质中,PO43-与MoO42-反应生成磷钼杂多酸,磷钼杂多酸与阳离子染料奎宁可形成稳定的离子缔合物,并在398.0 nm处产生灵敏的共振光散射峰。磷酸浓度在1-200μg/L范围内与共振光散射强度具有良好线性关系,对磷酸的检出限（3σ）可达到0.5μg/L。该方法操作简便、灵敏度高、选择性好,为进一步检测DNA打下了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 引言
• 1.1 滚环放大原理及其在生物领域的应用
• 1.2 纳米粒子在DNA杂交分析中的应用
• 1.3 共振光散射在分析中的应用
• 第2章 基于滚环放大技术及纳米粒子探针的DNA及其单碱基突变分析
• 2.1 前言
• 2.2 实验部分
• 2.3 结果与讨论
• 2.4 结论
• 第3章 磷钼杂多酸-奎宁体系共振光散射测定微量磷的研究
• 3.1 前言
• 3.2 实验部分
• 3.3 结果与讨论
• 3.4 结论
• 参考文献
• 硕士期间发表论文情况
• 致谢