论文摘要
肿瘤治疗的瓶颈之一是靶向性问题。对肿瘤组织的靶向性可以提高基因治疗的效果,避免对正常组织的损伤,并且能降低作为载体的微生物对机体的危害。条件复制型腺病毒是一类很有前景的抗肿瘤药物,它们能特异性的在肿瘤细胞中复制、增殖,从而杀死肿瘤细胞,而对正常细胞毒性很小。构建肿瘤特异性增殖病毒的方法之一是将病毒在正常细胞中复制必需的,而在肿瘤细胞中复制不需要的基因去除。ONYX-015就是基于此原理构建的一种条件复制型腺病毒。通过剔除腺病毒的E1B55kD基因,使病毒只能在p53途径失活的肿瘤细胞中复制。E1B55kD蛋白是腺病毒的早期基因编码的蛋白,能够与细胞中的p53蛋白结合从而抑制其功能。p53是宿主细胞抗腺病毒的主要蛋白。正常细胞受腺病毒感染后立即激活p53,诱导细胞凋亡,使得腺病毒不能再增殖,从而避免病毒扩散到临近组织。由于腺病毒E1B55kD蛋白能够抑制p53的功能,大多数正常细胞感染腺病毒后并没有立即出现凋亡,腺病毒仍然能够在正常细胞内复制。因此E1B55 kD蛋白是腺病毒在正常细胞中复制所必需的。而p53途径缺陷的肿瘤细胞被腺病毒感染后,p53不能被激活,因此缺失E1B55kD蛋白的腺病毒不能在正常细胞中复制,而能在P53失活的肿瘤细胞中大量复制和增殖,最终裂解肿瘤细胞并释放新的病毒去感染临近的肿瘤细胞以消灭肿瘤。ONYX-015联合化疗临床研究曾经取得很好的效果,但单独使用ONYX-015则疗效很差,只有15-20%。为了克服这一缺点,本组提出一种肿瘤治疗新策略:在肿瘤特异性增殖病毒中加入抗癌基因,将肿瘤的基因治疗与病毒治疗各自的优势结合起来,即肿瘤的基因病毒治疗。我们构建了一种类似于ONYX-015的溶瘤腺病毒载体ZD55,值得注意的是ZD55含有一个BglII克隆位点,可在此插入抗癌基因的表达框。这一系统在体外多种肿瘤细胞中显示出与ONYX-015相似的特异性杀伤效率和复制效率。重要的是,它携带的外源基因的表达量能随着病毒的复制和增殖大大提高。XAF1是经酵母双杂交分析而发现的能通过其锌指结构区与XIAP结合的基因。XIAP（X-linked Inhibitor of Apoptosis）是IAP（Inhibitor of Apoptosis）家族效力最强的成员,它可直接结合caspase-3,caspase-7和caspase-9从而抑制caspase的激活和细胞的死亡。据研究发现,XAF1能拮抗XIAP的anti-caspase作用,阻断XIAP对凋亡的抑制。进一步研究发现它在正常细胞中广泛表达,在许多肿瘤细胞内表达量却很低甚至检测不到。这些特征说明它很可能是一种抗癌基因。虽然XAF1本身并不能诱导细胞凋亡,但可以使肿瘤细胞对其他的死亡信号敏感。在细胞实验水平,发现它与TRAIL, TNFα,表鬼臼素合用能大大增强细胞凋亡。ZD55病毒复制晚期,即可诱导温和的细胞死亡。因此,我们将带有HAtag的XAF1表达框插入条件复制腺病毒ZD55中,以ZD55作为细胞死亡的诱发剂,分析XAF1的插入是否可以增强ZD55原本的细胞毒效应。因为E1B55kD的缺失,ZD55-XAF1能特异性的在多种肿瘤细胞内复制,不在正常细胞内复制,其复制能力与ONYX-015类似,插入外源基因并不影响其复制的特异性,也不降低它的复制能力。细胞实验显示,即使在MOI仅为0.1的情况下,ZD55-XAF1也能诱导强大的肿瘤特异性的细胞毒效应。而且,在荷SW620人结肠癌的裸鼠模型中,ZD55-XAF1显示出远高于非增殖腺病毒Ad-XAF1和单病毒ONYX-015的抑制肿瘤生长的能力。该治疗组的八只小鼠中,四只的肿瘤完全消退。这些说明,ZD55病毒治疗与XAF1基因治疗的联合,有望成为一种新的有效的抗肿瘤试剂。我们初步研究了ZD55-XAF1抗癌作用的机制。ZD55-XAF1感染的细胞显示出明显的细胞凋亡特征,然而与典型凋亡不同的是,它诱导的凋亡不依赖于caspase的激活。在ZD55-XAF1的作用下,Caspase-3和PARP均没有表现出很强的切割现象。加入泛caspase的抑制剂不能抑制ZD55-XAF1诱导的凋亡,却能抑制ZD55-TRAIL诱导的凋亡和caspase的切割。此外我们还发现,与过去报道不同的是,过表达XAF1并不能诱导XIAP从胞质转移到核。许多后续的研究也证实XAF1的作用并不依赖于XIAP。总之,本文构建的ZD55-XAF1系统表明靶向基因-病毒治疗的效果优于单纯的基因治疗,也优于单纯的病毒治疗。这是XAF1在靶向基因-病毒治疗中首次应用,这种治疗策略可能在肿瘤临床治疗上有着潜在应用价值。