过氧化氢酶基因工程菌的构建与发酵优化

论文摘要

过氧化氢酶（Catalase,简称CAT）,它能够高效催化H2O2分解成H2O和O2,从而避免H2O2与O2螯合生成有害的·OH。由于其特殊的性质和作用,使得它在纺织等领域越来越受到人们的青睐。目前市场上已有多种商品酶出售,应用前景良好。本实验室前期已从纺织废水中筛选出一株耐热耐碱的过氧化氢酶高产菌——枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）WSHDZ-01。其主要问题是总酶活相对较低,且胞外CAT产量不高,经细胞破碎获取胞内酶成本较高,不适合工业化生产的应用。本论文以基因工程技术为手段,从大肠杆菌（Escherichia coli）这种被广泛研究、应用的宿主菌着手,将来源于枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）WSHDZ-01的CAT基因整合到大肠杆菌（E. coli）中,构建出一株产CAT的基因工程菌并经过一系列优化,实现了重组菌胞外酶的大量分泌。主要研究结果如下:（1）将来源于Bacillus subtilis WSHDZ-01的katA基因插入质粒pET-20b（+）的信号肽下游,构建了表达载体pET-20b（+）/katA,并将其转化到宿主E. coli BL21（DE3）,获得了产CAT的基因工程菌E. coli BL21（DE3）（pET-20b（+）/katA）。通过IPTG诱导摇瓶培养,发现产酶并不高。由于E. coli细胞膜透性较低,且CAT分子量较大,不容易分泌到胞外。于是采用添加甘氨酸的方法促进重组CAT酶的胞外分泌,经过初步优化得出甘氨酸的添加策略为:初始发酵培养基为TB,温度30°C,培养基自然pH（7.0左右）,接种量为3%,在发酵过程的菌体生长对数中后期（约10 h左右）,添加200 mM甘氨酸能促进重组酶的胞外分泌,酶活可达到19211.7 U/mL。（2）对基因工程菌E. coli BL21（DE3）（pET-20b（+）/katA）进行摇瓶水平的发酵优化。首先通过单因素实验对碳源、氮源、温度和pH进行了优化,得出最适碳、氮源分别为甘油和安琪酵母粉,最适浓度分别为5.0 g/L和40 g/L,温度为30°C,pH影响不大,故选择自然pH。在此基础上,对这四个因素进行了正交试验设计,考察了各因素对工程菌生长及产酶的影响,最终确定发酵最佳条件为:甘油5.0 g/L,安琪酵母粉35 g/L,KH2PO4 2.32 g/L,K2HPO4 16.43 g/L,初始pH 7.5,发酵温度为先37°C后30°C。在此条件下,摇瓶发酵CAT的胞外酶活达到24152.7 U/mL。（3）对基因工程菌E. coli BL21（DE3）（pET-20b（+）/katA）在3 L发酵罐的发酵工艺进行了初步研究。不同初始甘油浓度下,菌体生长及CAT的胞外合成具有明显差异,较高初始甘油浓度有利于菌体生长及产酶,但发酵周期被延长,因此考虑到生长经济效益选择10 g/L作为发酵的初始甘油浓度。接着考察了不同搅拌转速下发酵过程中的动力学参数变化,较高的搅拌转速能大大促进菌体生长,但抑制了CAT的胞外分泌;而较低的搅拌转速虽然不利于菌体生长,却能得到较高的胞外酶活。故最终选择先400 r/min发酵,诱导后调为300 r/min的两阶段控制搅拌转速来进行发酵生产。（4）在上述研究基础上,考察了甘油补料策略对工程菌细胞生长及胞外产酶的影响。结果表明持续恒速流加甘油大大抑制了胞外CAT的分泌,流加结束后胞内酶才开始向胞外外分泌;而发酵过程中采用分批补料,通过补加15 g/L甘油,则可有效的提高胞外酶的产量,最终CAT胞外产量达到50369.5 U/mL。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 过氧化氢酶概述
• 1.1.1 过氧化氢酶的来源
• 1.1.2 过氧化氢酶的结构、功能及性质
• 1.1.3 过氧化氢酶的应用
• 1.2 过氧化氢酶基因工程的研究进展
• 1.2.1 CAT 的国内外研究现状
• 1.2.2 大肠杆菌表达系统
• 1.2.3 发酵过程优化的策略
• 1.3 立题依据及意义
• 1.4 本论文的主要研究内容
• 第二章 材料与方法
• 2.1 菌株与质粒
• 2.2 试剂与仪器
• 2.2.1 主要试剂
• 2.2.2 主要仪器
• 2.3 培养基
• 2.4 DNA 操作
• 2.4.1 基因组DNA 的提取
• 2.4.2 PCR 扩增
• 2.4.3 PCR 产物回收
• 2.4.4 pET-20b（+）质粒提取
• 2.4.5 酶切及柱回收
• 2.4.6 载体连接
• 2.4.7 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.4.8 转化大肠杆菌感受态细胞
• 2.4.9 转化子的筛选与鉴定
• 2.4.10 重组大肠杆菌的培养及表达
• 2.5 分析方法
• 2.5.1 酶液的制备
• 2.5.2 过氧化氢酶活性的测定
• 2.5.3 菌体浓度的测定
• 2.5.4 SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.5.5 甘油的测定
• 2.5.6 质粒稳定性测定
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 枯草芽孢杆菌CAT 基因在大肠杆菌中的克隆及表达
• 3.1.1 重组质粒pET-20b（+）/katA 的构建
• 3.1.2 重组E. coli BL21（DE3）(pET-20b（+）
• 3.1.3 重组E. coli BL21（DE3）（pET-20b（+）/katA）CAT 的分泌表达
• 3.1.4 质粒稳定性验证
• 3.2 重组E. coli BL21（DE3）（pET-20b（+）/katA）的摇瓶发酵条件优化
• 3.2.1 碳源对菌体生长及产酶的影响
• 3.2.2 氮源对菌体生长及产酶的影响
• 3.2.3 温度对菌体生长及产酶的影响
• 3.2.4 初始pH 对菌体生长及产酶的影响
• 3.2.5 正交试验设计进一步优化摇瓶发酵条件
• 3.2.6 摇瓶优化后的发酵曲线
• 3.3 重组E. coli BL21（DE3）（pET-20b（+）/katA）3 L 发酵罐的发酵优化
• 3.3.1 初始甘油浓度对重组菌发酵生产过氧化氢酶的影响
• 3.3.2 搅拌转速对重组菌发酵生产过氧化氢酶的影响
• 3.3.3 碳源补料对重组菌发酵生产过氧化氢酶的影响
• 第四章 结论与展望
• 4.1 结论
• 4.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文