羽扇豆醇对HELA细胞中miRNA表达的影响

论文摘要

羽扇豆醇是种植物天然提取物,近来被证明是种有效的癌细胞生长抑制药物。揭示其内在的抗癌分子机制,将有助于解决目前主流抗癌药物耐药性的问题,推动新型组合药物的研发进程。另方面,在抗癌研究领域,miRNA是最近的研究热点,其合成机制已基本明确,调节方式途径也越发充实,许多miRNA的功能被相继阐释,基于序列分析的高通量靶标预测数据库和二级结构分析工具也日趋成熟。因此,本研究用hela细胞建立了羽扇豆醇及对照药物的多时间节点处理模型,以miRNA的表达量变化为切入点进行分析。本研究首先以U6为内参,用核酸芯片的方法对药物处理模型进行了全miRNA分析,通过对多药物处理的核酸芯片分析结果进行比较,发现多种miRNA表达量变化极为相似,在对比点阵图中有成簇分布现象,并且同簇miRNA的高频共同靶标基因如ERBB4,TEAD和MeCP2等与癌细胞调节密切相关。稍后的研究中,对核酸芯片结果使用显著差异和聚类分析法进行统计整理,结合现有研究进展,认为miR-504和miR-34a的表达量变化可能与重要抗癌基因P53有关,因此使用荧光定量PCR技术对二者的多时间节点处理结果进行了检测,检测结果与核酸芯片结果致,即miR-504相对表达量显著下调,miR-34a在6h后至24h无显著变化。根据targetscan（http://www.targetscan.org/）靶标预测数据库检索和已有研究成果,P53是miR-504的直接靶标基因,其3’UTR上有两个miR-504 seed序列的直接结合位点,因此被miR-504直接抑制,对照羽扇豆醇抗癌效果,认为miR-504-p53是羽扇豆醇的潜在抑制癌细胞生长途径的部分。另方面,BCL-2、E2F3、E2F5、CDK4、CDK6、Cyclin E2、c-myc等被已有研究验证是miR-34a的靶标基因,这些蛋白基本都参与p53的细胞凋亡或细胞周期调控网络,与细胞的抗癌及癌变有密切关系,因此认为miR-504-p53-miR-34a-众多蛋白调节因子可能是羽扇豆醇抑制癌细胞的较完整分子途径。从已有实验结果来看,p53上调miR-34a的途径可能发生在药物处理24h以后。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 立题背景
• 1.2 羽扇豆醇简介
• 1.3 microRNA 研究进展
• 1.3.1 microRNA 的发现及其基本特征
• 1.3.2 miRNA 的生物学作用及其与肿瘤的关系
• 1.4 miRNA 表达的检测分析方法与技术
• 1.4.1 Northern blot 技术
• 1.4.2 荧光定量 PCR 技术
• 1.4.3 基于miRNA 的核酸芯片技术
• 1.5 课题研究的主要内容
• 第2章 材料和方法
• 2.1 材料及仪器
• 2.1.1 材料与试剂
• 2.1.2 实验仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 细胞miRNA 表达研究的技术路线
• 2.2.2 细胞培养和处理
• 2.2.3 总 RNA 提取
• 2.2.4 芯片扫描和分析
• 2.2.5 荧光定量 PCR 验证核酸芯片结果
• 第3章 细胞的药物处理与总 RNA 提取质量检测
• 3.1 处理后的hela 细胞形态学与数量变化
• 3.2 总RNA 提取结果检测
• 3.3 本章小结
• 第4章 核酸芯片扫描和分析
• 4.1 药物处理条件下miRNA 表达量的总体差异分析
• 4.2 药物处理前后miRNA 表达量在各区间的分布情况
• 4.3 相对表达量显著变化的miRNA 筛选及其靶标预测
• 4.3.1 药物处理后相对表达量显著变化的miRNA
• 4.3.2 目的miRNA 的靶标基因预测
• 4.4 羽扇豆醇与顺铂调解下潜在共同调节途径的筛选
• 4.4.1 羽扇豆醇与顺铂调节miRNA 表达情况的对比
• 4.4.2 潜在目的miRNA 靶标基因的筛选
• 4.5 本章小结
• 第5章 荧光定量 PCR
• 5.1 荧光定量RT—PCR 标准品的制备
• 5.2 标准曲线绘制
• 5.3 反转录效率的检测
• 5.4 内参U6 荧光定量PCR 检测
• 5.5 miR-504 荧光定量PCR 检测
• 5.6 miR-34a 荧光定量PCR 检测
• 5.7 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 附录一： 羽扇豆醇处理条件下相对表达量具有显著差异的miRNA
• 附录二： 成簇分布miRNA 的靶标基因
• 附录三： 所有样品目标miRNA 荧光定量 PCR 扩增曲线
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢