结核分枝杆菌lhp基因的原核表达及其产物的单克隆抗体研制

论文摘要

结核病是一种人兽共患的慢性消耗性传染病,已成为传染病中的第一号杀手和最大的死亡原因。特别在发展中国家结核病对于感染免疫缺陷病毒的人群来说尤为严重。随着艾滋病患者人数的增加、耐药性菌株的产生,结核病的发病率有逐年增加的趋势。因此,对于病情的流行,早期的感染诊断很关键,急需进一步改进现有的诊断方法。lhp基因是结核分枝杆菌特异性基因,在疫苗株BCG及环境中的非结核分枝杆菌中缺失。lhp与细菌的毒力相关,其缺失可以降低结核分枝杆菌的毒力。CFP-10是lhp的表达蛋白。本研究构建了原核表达CFP-10蛋白的重组大肠杆菌,获得具有生物活性的融合蛋白,并且制备了CFP-10特异性单克隆抗体。这些结果为研究结核分枝杆菌致病机理及免疫机理提供了重要条件,同时,为结核病诊断与检疫提供了新的试剂。一、结核分枝杆菌lhp基因的原核表达CFP-10作为免疫优势抗原,其功能研究可以加深对结核分枝杆致病机制、免疫机制的研究。本研究采用PCR及GeneSOEing技术分别扩增出lhp基因及lhp-linker-esat-6片段,分别插入原核表达载体,构建出重组菌BL21-pGEX-6p-1-lhp和BL21（DE3）-pET-30a（+）-lhp-linker-esat-6,经IPTG诱导表达得到融合蛋白。SDS-PAGE结果显示表达的融合蛋白GST-CFP-10和His-CFP-10-linker-ESAT-6与理论值大小相符,为进一步研究该蛋白的免疫学功能提供了条件。二、结核分枝杆菌CFP-10蛋白单克隆抗体的制备与鉴定应用淋巴细胞杂交瘤技术,以重组菌BL21（DE3）-pET-30a（+）-lhp表达的融合蛋白His-CFP-10为免疫原经纯化免疫8周龄BALB/c小鼠,皮下注射,100μg/只。首免时,抗原与等量弗氏完全佐剂混合乳化;二免、三免时抗原与等量不完全弗氏佐剂混合乳化,间隔时间为两周;以不加佐剂的抗原尾静脉加强免疫,100μg/只,3d后,取免疫鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0-Ag-14进行融合。以纯化的GST-CFP-10作为检测抗原,用间接ELISA方法筛选阳性克隆,获得7株稳定分泌CFP-10 McAb的细胞株,命名为2E7、6E8、7B11、7C2、7C3、7D4、8F6,腹水的效价依次为1×106、1×106、1×106、1×105、1×105、1×104、1×104。除6E8、7811 McAb亚类为IgG1外,其余均为IgG2b。Dot-ELISA试验表明,7株单抗只与表达His-CFP-10、GST-CFP-10及His-CFP-10-linker-ESAT-6的重组大肠杆菌反应,与其它菌株不反应。Western-blot试验显示7株单抗均能与融合蛋白His-CFP-10发生反应,出现特异性条带,而与BL21（DE3）-pET-30a（+）不反应。以上试验证实,筛选获得的McAb 2E7、6E8、7811、7C2、7C3、7D4、8F6是针对CFP-10的特异性单克隆抗体,它们为研究结核分枝杆菌CFP-10蛋白功能以及结核病的诊断提供了重要的条件。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 目录
• 符号说明
• 第一章 结核病流行与诊断研究进展
• 1 结核病的流行状况
• 2 结核分枝杆菌致病机制
• 3 结核分枝杆菌引发的T细胞免疫反应
• 4 结核病诊断技术
• 5 CFP-10蛋白在诊断中的意义
• 参考文献
• 第二章 结核分枝杆菌lhp基因的原核表达
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株、质粒
• 1.1.2 试剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 PCR扩增lhp基因
• 1.2.2 PCR扩增lhp-linker-esat-6片段
• 1.2.3 原核表达质粒pGEX-6p-1-lhp、pET-30a（+）-lhp-linker-esat-6的构建与鉴定
• 1.2.4 lhp基因在重组菌的原核表达及融合蛋白纯化
• 1.2.4.1 重组菌BL21（DE3）-pET-30a（+）-lhp的表达及融合蛋白纯化
• 1.2.4.2 重组菌BL21-pGEX-6p-1-lhp的表达及融合蛋白纯化
• 1.2.4.3 重组菌BL21（DE3）-pET-30a（+）-lhp-linker-esat-6的原核表达
• 2 结果
• 2.1 lhp基因的PCR扩增及表达载体构建
• 2.2 lhp-linker-esat-6片段扩增及表达载体构建
• 2.3 重组菌表达产物的SDS-PAGE分析
• 2.3.1 重组菌的BL21（DE3）-pET-30a（+）-lhp的SDS-PAGE分析
• 2.3.2 重组菌BL21-pGEX-6p-1-lhp的SDS-PAGE分析
• 2.3.3 重组菌BL21（DE3）-pET-30a（+）-lhp-linker-esat-6的SDS-PAGE分析
• 3 讨论
• 参考文献
• 第三章 结核分枝杆菌CFP-10蛋白单克隆抗体的制备及鉴定
• 1 材料和方法
• 1.1 菌株和试剂
• 1.1.1 菌株
• 1.1.2 试剂
• 1.1.3 主要仪器设备
• 1.1.4 实验动物和细胞系
• 1.2 方法
• 1.2.1 免疫原的制备
• 1.2.2 检测抗原的制备
• 1.2.3 动物免疫
• 1.2.4 细胞融合
• 1.2.5 阳性克隆的筛选
• 1.2.5.1 间接ELISA检测方法的建立
• 1.2.5.2 筛选阳性细胞克隆
• 1.2.5.3 阳性杂交瘤细胞的克隆化
• 1.2.6 腹水制备
• 1.2.7 单抗生物学特性鉴定
• 1.2.7.1 单抗亚类的鉴定
• 1.2.7.2 腹水效价的测定
• 1.2.7.3 单抗特异性的鉴定
• 1.2.7.3.1 Dot-ELISA实验
• 1.2.7.3.2 Western-blot实验
• 2 结果
• 2.1 杂交瘤细胞株的建立
• 2.2 单抗生物学特性鉴定
• 2.3 单抗特异性鉴定
• 2.3.1 单抗反应谱的测定
• 2.3.2 Western-blot分析结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 致谢