白术黄芪方、白术AMPS-Ⅱ、黄芪注射液对Caco-2单细胞层屏障影响的实验研究

论文摘要

研究背景 祖国医学认为,脾胃为气血生化之源,后天之本。脾的功能旺盛才能保证机体健康、抵御外邪侵袭。如《灵枢·五癃津液别》篇云:“脾为之卫”。肠道拥有与外界相接触的最广大面积,许多毒素和致病因子如细胞因子等可经破坏的肠道屏障进入血液循环,不仅引起局部损害,亦可导致全身疾病。所以研究益气健脾方药对肠道屏障的作用具有重要的意义。 肠道屏障包括机械屏障、生物屏障、化学屏障及免疫屏障。肠道机械屏障主要由肠粘膜上皮细胞、细胞间紧密连接等构成。肠上皮细胞包括多种生物功能不同的细胞,是肠道机械屏障的主要组织结构基础。 肠上皮细胞之间一种特殊的膜性结构——紧密连接（tight junction）,位于基底外侧细胞与细胞间的最上端,对来自于肠道的众多毒素和免疫原起着首当其冲的抵御作用,它是维持肠粘膜通透性（mucosa permeability）的重要组织成分,生理情况下只能允许2μm大小的离子或小分子物质通过,以沟通机体内、外环境,紧密连接调节着离子、水分子、大分子甚至癌细胞的通路,因此与水肿、腹泻、血性转移等密切相关;任何原因使紧密连接成分发生改变,或直接损伤了紧密连接,都会造成肠粘膜对肠内容物的通透性增高,细菌或毒素等得以入侵体内,激起一系列病理生理改变。 益气健脾中药是治疗脾虚证的主要药物,由党参、白术、黄芪、甘草等为主要药物组成的四君子汤、补中益气汤、黄芪建中汤、参苓白术散、白术黄芪汤等是治疗脾虚证的经典方剂。益气健脾中药可通过影响肠道机械屏障、化学屏障、免疫屏障、生物屏障而发生作用。具体体现在促进肠上皮细胞修复、清除毒素和减少致炎因子、减少细菌移位和调节肠道菌群失调、促进肠道分泌SIgA、改善肠道血循环等方面。 现代药理研究认为益气健脾方药能增强和调节消化系统的功能,对胃肠粘膜有增强屏障功能,有促进粘膜防护因子分泌等作用。益气健脾方药主要用于治疗有脾虚表现的病证,而脾虚证反映了以消化系统功能障碍为主的全身性综合病理状态,在脾虚患者或脾虚动物的肠上皮细胞及上皮细胞之间的细胞连接可出现异常,因此益气健脾中药对脾虚证的作用机理之一可能是对胃肠粘膜的保护或修复。 本实验室2000年引进了大鼠小肠隐窝干细胞（intestinal epithelial cell line,IEC-6）,将其用于胃肠粘膜修复药物作用的研究。研究结果发现黄芪注射液（主要含黄芪皂苷）可促进IEC-6细胞分化和迁移,亦可促进IEC-6细胞白介素6（IL-6）的分泌;白术AMPS-Ⅱ（主要含白术糖复合物）具有促进IEC-6细胞分化的作用,可明显改变IEC-6细胞的形态,其影响程度与药物作用的剂量和时间呈正相关,并可通过激活鸟氨酸脱羧酶促进IEC-6细胞移行,可刺激IEC-6细胞的绒毛蛋白mRNA表

论文目录

• 引言
• 第一部分 研究背景
• 第一章 益气健脾法及其药物研究进展
• 第一节 脾虚与益气健脾法
• 第二节 白术及其有效部位的药理与临床研究进展
• 1. 药理作用
• 2. 临床应用
• 参考文献
• 第三节 黄芪及其有效部位的药理与临床研究进展
• 1. 黄芪总皂苷
• 2. 黄芪总黄酮
• 2.1 药理作用
• 2.2 临床作用
• 3. 黄芪多糖
• 3.1 药理作用
• 3.2 临床应用
• 参考文献
• 第四节 甘草及其有效部位的药理与临床研究进展
• 1. 甘草酸
• 2. 甘草总黄酮的药理作用
• 参考文献
• 第五节 益气健脾中药复方药理作用研究进展
• 1. 益气健脾代表方四君子汤的药理研究
• 2. 对其它益气健脾方剂的研究
• 2.1 药理研究
• 2.2 临床研究
• 参考文献
• 第二章 益气健脾中药与肠道屏障保护作用研究概况
• 第一节 肠道屏障研究概况
• 1. 肠道机械屏障
• 1.1 肠粘膜上皮细胞
• 1.2 紧密连接
• 1.3 菌膜
• 2. 肠粘膜生物屏障
• 3. 肠粘膜化学屏障
• 4. 肠粘膜免疫屏障
• 4.1 M细胞
• 4.2 潘氏细胞
• 5. 肠道动力障碍
• 第二节 益气健脾方药肠粘膜屏障保护作用研究概况
• 1. 脾虚动物及人肠道屏障受损的表现
• 2. 益气健脾方药对肠道机械屏障的保护作用
• 3. 益气健脾方药对肠道免疫屏障的保护作用
• 4. 益气健脾方药对肠道生物屏障的保护作用
• 参考文献
• 第二部分 实验研究
• 第一章 培养时间对Caco-2单细胞层生长和通透性的影响
• 1. 实验材料与方法
• 1.1 主要试剂及仪器
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 细胞培养
• 1.2.2 Caco-2细胞的生长曲线
• 1.2.3 Caco-2单细胞层通透性和形态的观察
• 2. 实验结果
• 2.1 Caco-2细胞生长曲线
• 2.2 Caco-2细胞生长在聚碳酸酯膜上不同天数的形态
• 2.3 Caco-2单细胞层通透性的观察
• 3. 讨论
• 参考文献
• 第二章 白术黄芪方对Caco-2细胞增殖及对单细胞层通透性、ZO-1表达的影响
• 1. 实验材料和方法
• 1.1 主要实验材料
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 Caco-2细胞的培养
• 1.2.2 MTT法检测-Caco-2细胞增殖情况
• 1.2.3 氚标法检测Caco-2细胞增殖情况
• 1.2.4 酚红透过实验观察单细胞层细胞连接和通透性情况
• 1.2.5 免疫荧光法和Western Blot法检测紧密连接相关蛋白ZO-1的表达
• 2. 实验结果
• 2.1 MTT法检测Caco-2细胞增殖情况
• 2.2 氚标法检测Caco-2细胞增殖情况
• 2.3 酚红透过实验对单细胞层通透性的影响
• 2.4 白术黄芪方对紧密连接相关蛋白ZO-1分布的影响
• 2.5 白术黄芪方对紧密连接相关蛋白ZO-1分布的影响
• 3. 讨论
• 参考文献
• 第三章 白术AMPS-II、黄芪注射液对Caco-2单细胞层细胞连接、通透性、ZO-1蛋白表达的影响
• 1. 仪器与试剂
• 2. 实验方法和步骤
• 2.1 细胞培养
• 2.2 酚红透过实验观察单细胞层细胞连接和通透性情况
• 2.3 白术AMPS-II、黄芪注射液对紧密连接相关蛋白ZO-1表达的影响
• 2.3.1 免疫荧光法
• 2.3.2 Western Blot法
• 3. 实验结果
• 3.1 酚红透过实验观察白术AMPS-II、黄芪注射液对Caco-2单细胞层细胞连接和通透性的影响
• 3.2 分光光度计测得酚红透过值
• 3.3 免疫荧光法Western Blot法观察白术AMPS-II、黄芪注射液对紧密连接相关蛋白ZO-1表达的影响
• 3.4 Western Blot法观察白术AMPS-II、黄芪注射液对紧密连接相关蛋白ZO-1表达的影响
• 4. 讨论
• 参考文献
• 结语
• 附录
• 本论文中涉及的缩略语
• 在读期间发表的文章
• 致谢