猪胃肠炎病毒的分离鉴定及S基因的克隆、序列分析与原核表达

论文摘要

猪传染性胃肠炎（Transmissible Gastroenteritis,TGE）是由猪传染性胃肠炎病毒（Transmissi-ble Gastroenteritis virus,TGEV）引起的一种以仔猪呕吐、水样腹泻和高死亡率为主要特征的传染病。各种年龄的猪都可感染,且感染猪生长缓慢,饲料报酬率低,2005年以来,河南TGE的流行呈明显上升趋势,给养猪业造成了巨大的经济损失。本研究根据GenBank上发表的TGEV基因序列（NC002306）,针对TGEV S基因设计合成了一对引物,以TGEV疫苗株（YM）为模板,建立了TGEV的RT-PCR检测方法。利用建立的方法检测TGEV、PRRSV、HCLV、PCV2、PRV,只有TGEV扩增出预期497bp的条带,而其他未出现任何条带,说明了所建检测方法的高度特异性,并且可检测10-5倍稀释的cDNA模板。运用所建方法对新乡原阳（XXYY）、开封（KF）、新郑（XZ）、驻马店（ZMD）、新乡获嘉（XXHJ）、南阳（NY）6个发病猪场疑似TGEV病料组织中的病毒RNA进行RT-PCR扩增,均可得到与预期大小497bp相符的特异性片段,同时用BanII对胶回收后的PCR扩增产物进行酶切鉴定,产物可被酶切成与预期大小相符的373bp和124bp两条片段。运用市售TGEV抗原检测试纸卡进行复检,与RT-PCT检测结果完全一致。参照GenBank发表的TGEV基因序列（登录号NC002306）,利用自行设计的一对引物,以TGEVXZ、NY、YM、XXYY、KF株的PK-15细胞培养物为材料,采用RT-PCR技术扩增出S基因,运用PGM-T和PMD18-T两种载体,通过TA克隆,获得重组质粒PGM-XZ-S、PGM-NY-S、PGM-YM-S、PMD-XX-S和PMD-KF-S。经序列分析得知,河南分离株之间的同源性很高,核苷酸同源性为99.0%-99.8%,氨基酸同源性为97.0%-99.0%;河南株和疫苗株的核苷酸同源性为99.0%-99.7%,氨基酸同源性为97.0%-98.5%;XZ株与国外的Purdue株核苷酸同源性最高达99.7%,氨基酸同源性最高达99.0%;XZ株与SC-Y株氨基酸同源性最高达100%,但XX、KF、NY株与SC-Y株核苷酸同源性分别依次为99.0%、98.5%、99.5%。说明S基因是高度保守的,也说明不同地方的分离株存在一定的差异。分析还得知由河南分离株扩增的片段均存在抗原位点,这为以后的研究奠定了基础。以自行构建的PGM-XZ-S为材料进行PCR扩增,双酶切后克隆到原核表达载体pET32a（+）中,构建原核表达载体pET-XZ-S,将重组原核表达载体pET-XZ-S转化到E.coli BL21（DE3）进行诱导表达,产物通过SDS-PAGE检测,目标蛋白获得了大量表达,通过优化试验条件,确认最佳IPTG诱导浓度为0.6mmol/L,最佳诱导时间为3h,融合蛋白大小为42KD。Western Blotting检测结果显示,融合蛋白具有免疫原性,为研究TGEV亚单位疫苗、制备诊断抗原和建立ELISA方法奠定了基础。

论文目录

• 致谢
• 中文摘要
• 文献综述
• 实验一 猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）RT-PCR检测方法的建立及HN株的分离与鉴定
• 引言
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 小结与讨论
• 实验二 猪传染性胃肠炎病毒猪河南株S基因的克隆与序列分析
• 引言
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 小结与讨论
• 实验三 TGEV XZ株S基因原核表达载体的构建及初步表达
• 引言
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 小结与讨论
• 英文摘要
• 参考文献
• 附录:溶液配制