罗晓燕林玉娜曾涛刘莉治胡国媛
广州市疾病预防控制中心广东广州510440
【摘要】目的采用超高压液相色谱-串联质谱联用技术UPLC-MS/MS，同时测定小麦粉中5种真菌毒素。方法样品用84/16的乙腈/水混合液匀浆提取超声提取30min，离心后，上清液经MycoSep226多功能净化柱净化，经AcquityUPLCBEHC18柱（50mm×2.1mm，1.7μmparticlesize）分离，6min内5种真菌毒素完全分离。结果采用外标法定量，在2μg/L～100μg/L的浓度范围内呈良好的线性关系，r>0.996。加标平均回收率为：82%～110，RSD：1.7%～9.6%；检出限<2.0μg/kg。结论该方法具有预处理简单、检测速度快、灵敏度高的优点，可适用于小麦粉样品中真菌毒素的确认和准确定量检测，可满足我国对真菌毒素的最低检出要求。运用建立的方法对广东省各地的396份小麦粉进行含量测定。
【关键词】外标法；UPLC-MS/MS；小麦粉；真菌毒素
【中图分类号】R657.63【文献标识码】A【文章编号】1276-7808（2015）-07-369-02
大多数的谷物非常容易遭受真菌的污染，严重影响着食品安全[1]。单端孢霉烯族B类毒素[Deoxynivalenol（DON）、3-Acetyldeoxynivalenol（3-ADON）、15-Acetyldeoxynivalenol（15-ADON）、Nivalenol（NIV）、Zearalenone（ZON）]，是最为普遍存在的污染真菌。如果食用含上述毒素的谷物食品，则会产生极大的毒副作用。单端孢霉烯族B类毒素能够导致厌食、呕吐、贫血、出血以及免疫抑制的症状[2]。因此，欧盟对脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）、玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZON）等分别做出了500～1000μg/kg，20～75μg/kg的限量规定；食品安全国家标准GB2761—2011食品安全国家标准食品中真菌毒素限量中规定谷物及其制品（大麦、小麦、麦片、小麦粉）中DON限量指标是1000μg/kg，谷物及其制品（小麦、小麦粉）中ZON限量指标是60μg/kg。
目前检测真菌毒素的检测方法主要有薄层色谱法、气相色谱法、酶联免疫法、高效液相色谱法和液相色谱－质谱联用法；检测ZON的国标为GB/T21982—2008，液相色谱－质谱联用法，检出限为1μg/kg，国标GB/T5009.209——2008为高效液相色谱法，检出限为5μg/kg；检测DON的国标为GB/T23503—2009，高效液相色谱法，检出限为100μg/kg。目前没有能同时检测上述5种真菌毒素的国标方法，为完成本次小麦粉中真菌毒素污染情况调查，进行超高压液相色谱—串联质谱联用法同时测定小麦粉中5种真菌毒素的方法研究。
1材料和方法
1.1主要试剂和仪器雪腐镰刀菌烯醇Nivaleno（lNIV）纯度：99%，玉米赤烯酮Zearalenone（ZON）纯度：99%，脱氧雪腐镰刀菌烯醇Deoxynivalenol（DON）纯度：99%，3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇3-Acetyldeoxynivalenol（3-ADON）纯度：99%，15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇15-Acetyldeoxynivalenol（15-ADON）纯度：99%。购自德国FLUKA公司。MycoSep226AflaZon+Multifunctional多功能净化柱（美国RomerLabs公司）甲醇（质谱纯）、乙腈（质谱纯）、醋酸铵（质谱纯）、氨水（质谱纯）、超纯水。
1.2仪器
色谱仪器：WatersAcquityUltraPerformanceLCsystem（美国Waters公司）；质谱仪器：XevoTQMS（美国Waters公司）
1.2.1色谱条件：AcquityUPLCBEHC18柱（50mm×2.1mm，1.7μmparticlesize美国Waters公司）；流动相A：0.2%的氨水，流动相B：乙腈。梯度洗脱：0～6min流动相A97%～2%，6～7min保持流动相A比例2%，7～7.8流动相A2%～97%，7.8～10min保持流动相A比例97%。进样量为10μL流速为0.35ml/min。
1.2.2质谱条件：XevoTQMS（美国Waters公司）；仪器采用负离子接口模式，毛细管电压：2.5kV；锥孔电压：40V；离子源温度：150℃；锥孔反吹气流量：50L/h；脱溶剂气温度：350℃；脱溶剂气流量：550L/h；碰撞池压力：3.0×10-3mbar。数据采集0～6min，6～10min自动切换至废液。采用多反应监测（MRM）模式采集质谱数据，MRM质谱参数见表1
1.3样品来源分别从广东省22个县市的超市农贸市场随机获取396份小麦粉样品，室温下保存。
1.4标准溶液的配制分别称取5种真菌毒素标准品适量，84/16的乙腈/水溶液溶解，分别配制成100μg/mL的储备液，通过84/16的乙腈/水溶液梯度稀释，制备成为一系列标准溶液，浓度为5.0μg/L、10.0μg/L、20.0μg/L、50.0μg/L、100.0μg/L、200.0μg/L、500.0μg/L，各取15.00mL分别添加进空白的小麦粉样品（即不含被测组份的样品）中，每份空白的小麦粉样品准确称量为5.00g，超声波超声30min，5000r/min下离心15min。吸取上层清液5mL过MycosepTM226多功能净化柱，净化后液体用0.22μm微孔滤膜过滤，进样10μL，制成标准曲线。1.5样品前处理准确称取小麦粉样品5.00g于40mL的离心管中，加入15mL乙腈/水（84+16）溶液。超声波超声30min，5000rpm下离心15min。吸取上层清液5mL过MycosepTM226多功能净化柱，净化后液体用0.22μm微孔滤膜过滤，进样10μL。
2结果与分析
2.1样品预处理方法优化本试验希望寻找一种方便快速的前处理方法，在保证回收率及检测灵敏度的前提下尽量简化前处理步骤，MycosepTM226多功能净化柱是用于真菌毒素样品检测的高效率前处理工具，采用MycosepTM226多功能净化柱，通过试验考察15mL、20mL、25mL提取液体积对回收率的影响，确定乙腈/水（84/16）提取液的最佳提取体积为20mL。
2.2色谱条件的优化要实现5种真菌毒素尽可能分离，必须选择合适的流动相，实验中弱洗脱溶剂中分别加入5mmol/L醋酸胺、0.2%氨水、5mmol/L甲酸胺、5mmol/L二乙胺（用醋酸将pH调至8）等缓冲盐进行试验，结果表明加入0.2%氨水后，灵敏度最高。有机相选择乙腈。
2.3质谱条件的优化为提高检测的灵敏度，通过对毛细管电压、锥孔电压、离子源温度、锥孔反吹气流量、脱溶剂气温度、脱溶剂气流量、碰撞池压力以及质量分析器参数进行优化，并对5种真菌毒素的碰撞能量进行优化，以提高各检测组分的检测灵敏度。优化后的参数见（1.1），在该条件下，以各目标化合物的定量离子、定性离子为选择离子，则质量浓度为2.0μg/L的真菌毒素混标的选择离子色谱图，见图1。
3.总结
本研究建立了一种高灵敏度、高选择性、合理、可靠、快速的同时测定小麦粉中真菌毒素的UPLC串联质谱的新方法。通过多功能净化柱净化，同时选择合适的流动相及流动相梯度，并利用串联质谱仪本身的自动切换功能，较好的消除基质干扰，达到精确定量的目的。在广东省22个县市的超市农贸市场随机抽取396份小麦粉样品进行检测，发现60%以上样品受到真菌毒素污染，因此有必要对谷物中真菌毒素进行含量测定，以控制谷物样品中真菌毒素的污染。
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作者简介：
罗晓燕（1964—），女，硕士研究生，主任技师，主要从事理化检验工作