论文摘要
研究背景及目的人类乳头瘤病毒（human papilloma virus,HPV）不但是宫颈癌发生和发展的重要因素,还与外阴和肛周鳞癌的形成密切相关。在大约70100%的肛周鳞癌中可以检出高危型HPV-DNA。其中,HPV16是最为常见的高危型HPV。HPV16 E7可参与大多数宫颈癌和某些特定部位上皮肿瘤尤其是头颈部和生殖器等部位鳞癌的成瘤过程。大量临床病理研究证实:在口腔癌、乳腺癌、胃癌等人类多种恶性上皮肿瘤中,HPV16 E7的表达与肿瘤分化低、易发生淋巴结转移以及预后差密切相关。TGFβ是一类对上皮细胞生长有潜在抑制作用的细胞因子。TGFβ信号从膜受体到胞核的细胞内转导由多种Smad蛋白介导和调节。Smad7是TGFβ信号转导通路中最为重要的负性调节因子,Smad7表达升高可对TGFβ信号转导通路起到限制作用。已有研究发现,TGFβ在部分HPV16感染的恶性肿瘤组织中表达升高,然而却并未发挥抑制肿瘤增殖的作用;Smad7在包括表皮鳞癌在内的多种上皮源性恶性肿瘤中也呈表达上调。近期研究还发现,Smad7高表达是胃癌患者出现淋巴结转移的一个独立的相关因素。Smad7在癌形成和转移过程中的作用可能与其具有阻断TGFβ信号转导通路和上调增殖相关调节因子的表达有关。针对TGFβ在部分HPV16感染的恶性肿瘤组织中表达升高,却不能发挥抑制肿瘤增殖作用的现象,以及HPV16与外阴和肛周鳞癌形成的密切关系和Smad7在癌形成和转移过程中的重要作用,我们设想,在已有癌形成的基础上HPV16 E7是否还可影响肿瘤细胞的增殖和侵袭呢?HPV16 E7是否有可能通过影响Smad7的表达而增加皮肤鳞状细胞癌的侵袭和转移呢?为此,我们以HPV16与TGFβ信号转导通路中重要的抑制性因子Smad7的关系作为研究切入点,检测皮肤鳞癌组织中HPV16 E7和Smad7的表达,并分析其表达与皮肤鳞癌临床病理特征的关系;构建HPV16 E7表达载体,研究外源性HPV16 E7对人表皮鳞癌A431细胞的作用,探讨HPV16 E7作为一种独立因素对A431细胞中Smad7等分子表达的影响以及对A431细胞生长、增殖和侵袭的影响;并观察A431细胞在Smad7沉默后增殖和侵袭等生物学行为的变化。深入研究HPV16 E7和Smad7在皮肤鳞状细胞癌发生、发展和转移中的作用,对于全面理解皮肤鳞状细胞癌发生、发展及转移机制具有重要意义。研究方法与结果1.应用PCR和免疫组织化学技术分别检测HPV16 E7基因和Smad7蛋白在37例皮肤鳞状细胞癌组织和30例正常皮肤中的表达情况。37例皮肤鳞状细胞癌中的HPV16 E7阳性检出率为16.2%（6/37）,与正常皮肤比较有统计学差异（P <0.05）;Smad7的阳性表达率为86.5%（32/37）。HPV16 E7表达与淋巴结转移（P <0.01）和组织分化程度显著相关（P < 0.05）。Smad7的表达水平与淋巴结转移和分化程度也有相关性（P < 0.05）,并且皮肤鳞状细胞癌中HPV16 E7的感染与Smad7的阳性表达之间具有相关性（P < 0.05）。2.应用基因工程技术成功构建了HPV16 E7真核表达载体,并以A431表皮鳞癌细胞为靶细胞,通过基因转染的方法使A431细胞高表达HPV16 E7。通过qRT-PCR和Western blotting检测发现,转染后的A431细胞中Smad7 mRNA和蛋白表达水平升高,ELISA实验证实转染HPV16 E7后的A431细胞TGFβ1的分泌水平升高。3. WST-1和Transwell实验结果显示,HPV16 E7过表达能够促进A431细胞的生长,增加A431细胞的迁移和侵袭性。流式细胞仪检测还发现高表达HPV16 E7可加速A431细胞的细胞周期进程,使S期细胞数目增多。4. Western blotting实验结果显示,HPV16 E7过表达能够下调A431细胞中Smad4的表达,上调PCNA和EGFR蛋白的表达水平。免疫荧光和激光共聚焦实验还发现了HPV16 E7可影响Smad4蛋白的亚细胞定位,使Smad4出现胞核到胞浆的转位。5.成功构建了Smad7干扰载体-pcDNA6.2-miR-Smad7干扰质粒。该质粒被转染至A431细胞后特异性下调了细胞中Smad7的表达。进一步进行WST-1和Transwell实验发现,Smad7沉默可减缓A431细胞增殖速度,减弱该肿瘤细胞的迁移和侵袭。流式细胞术检测发现,Smad7沉默能够使A431细胞的细胞周期减慢,凋亡尤其是早期凋亡增加。6. Western blotting实验结果还显示,Smad7沉默后A431细胞的TGFβRI、Smad4和Bax的表达水平较对照组增加,PCNA、C-myc和EGFR蛋白表达水平显著下调。Bcl-2、Smad1/2/3和p-Smad2/3蛋白的表达水平未有明显变化。免疫荧光和激光共聚焦显微镜观察发现,Smad7沉默增加了Smad4蛋白向胞核内的聚集。7.通过皮下注射肿瘤细胞悬液的方法分别构建了A431细胞BALB/C裸鼠荷瘤模型和Smad7沉默的A431细胞BALB/C裸鼠荷瘤模型,苏木素伊红染色显示移植瘤具有表皮鳞癌的组织病理学特征。Smad7沉默的A431细胞BALB/C裸鼠荷瘤模型组的移植瘤生长速度较对照组（Smad7未沉默的A431细胞BALB/C裸鼠荷瘤模型组）移植瘤的生长速度减慢。应用扫描电子显微镜和透射电子显微镜发现,Smad7沉默能够使A431细胞的核浆比例有所下降并诱导细胞衰老和凋亡。研究结论HPV16 E7是皮肤鳞癌发生的一个独立性因素,其存在具有增强皮肤鳞癌淋巴结转移的危险性。HPV16 E7可通过诱导Smad7的表达可干扰TGFβ信号转导,从而促进A431细胞生长,增强其转移和侵袭性。特异性抑制Smad7的表达能够部分恢复细胞对TGFβ信号的反应性,使A431细胞恶性程度减低,转移和侵袭性减弱,并发生衰老和凋亡。
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