中华绒螯蟹性早熟神经内分泌发生机制的初步研究

论文摘要

中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）又称河蟹,是我国特有的水产珍品,广泛分布于我国南北各地淡水水域中。由于营养价值高和风味独特而蜚声海内外。但在各地养殖过程中普遍存在着1龄蟹性早熟的现象,性早熟河蟹个体小,死亡率高,严重制约了其养殖业的发展,给生产带来巨大损失。河蟹的性早熟发生机制非常复杂,其真正的机理还不清楚。通常认为导致性早熟是外在因素和内在因素综合作用的具体表现。多数学者着重研究和分析了河蟹发生性早熟的外在因素,如环境温度、水质（pH值、盐度）、水深及人为因素中的放养密度、营养等与河蟹性早熟的关系,普遍认为水体积温高和营养过剩是导致河蟹发生性早熟的主要原因;而对于内在因素的研究则较少。本研究针对上述问题,从以下三个方面对河蟹性早熟问题的神经内分泌机制进行了初步的研究。 1.河蟹的眼柄视神经节位于复眼之下,自上到下分为外髓、内髓和端髓三部分。窦腺是储存和释放激素的场所,位于内髓与端髓之间侧面。采用组织切片技术,分别在光镜和电镜下观察比较性早熟河蟹与正常成熟蟹的眼柄神经内分泌结构,尤其是窦腺的结构差异,发现光镜下结构差异不显著,而电镜下窦腺结构差异明显:第Ⅱ种颗粒在性早熟河蟹中存在较少,而且还有一种颗粒（Ⅶ）在正常成熟蟹中没有观察到,但在性早熟蟹中存在较多。推测可能与性早熟的发生有关。 2.通过测定和比较性早熟河蟹与正常成熟蟹的视神经节水溶性总蛋白的浓度、pH值、分子量、等电点、蛋白质组图谱的差异,发现性早熟组织蛋白质总浓度要低于正常组织,pH值也要比正常组织低。分子量在100Ku以上和50Ku左右有明显的差异。等电点的差异主要集中在酸性蛋白上。在蛋白质组图谱中具有明显差异的蛋白质点有24个。 3.初步克隆了河蟹性腺抑制激素的基因。从正常发育但还未成熟的河蟹眼柄视神经节中提取总RNA,利用RT-PCR技术获得了一条基因序列的片断,连接测序载体pGEM-Teasy,转化大肠杆菌JM109,经过抗性筛选,分子量大小比较,酶切和PCR鉴定等多种方法验证,筛选出7个阳性克隆。通过测序发现同源性不高,推测可能是性腺抑制激素的基因。

论文目录

• 第1章 前言
• 1.1 中华绒螯蟹性早熟发生概述
• 1.2 中华绒螯蟹性早熟发生机制研究进展
• 1.3 中华绒螯蟹眼柄视神经节内分泌结构和雌性生殖系统
• 1.3.1 眼柄视神经节内分泌结构
• 1.3.2 雌性生殖系统结构与发育
• 1.4 甲壳动物高血糖素家族及性腺抑制激素研究现状
• 1 .4.1高血糖激素
• 1 .4.2蜕皮抑制激素
• 1 .4.3’性腺抑制激素
• 1.5 研究目的和意义
• 第2章 性早熟与正常的中华绒螯蟹视神经节和窦腺结构的比较
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 材料
• 2.2.2 仪器
• 2.2.3 方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 光镜下视神经节结构
• 2.3.2 光镜下窦腺显微结构
• 2.3.3 电镜窦腺的超微结构
• 2.3.4 神经分泌颗粒的释放
• 第3章 性早熟与正常中华绒螯蟹视神经节蛋白生化性质比较
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 材料
• 3.2.2 仪器
• 3.2.3 方法
• 3.2.3.1 蛋白质浓度及pH值
• 3.2.3.2 蛋白质分子量的差异比较
• 3.2.3.3 等电点差异比较
• 3.2.3.4 双向电泳-蛋白质组图差异比较
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 蛋白质浓度及pH值
• 3.3.2 蛋白分子量的差异比较
• 3.3.3 等电点差异比较
• 3.3.4 双向电泳-蛋白质组图差异比较
• 第4章 中华绒螯蟹性腺抑制激素基因的克隆
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 材料
• 4.2.2 仪器
• 4.2.3 方法
• 4.2.3.1 引物设计
• 4.2.3.2 中华绒螯蟹视神经节总RNA的提取
• 4.2.3.3 中华绒螯蟹性腺抑制激素基因的获得
• 4.2.3.4 中华绒螯蟹性腺抑制激素基因的鉴定
• 4.2.3.5 测序结果的生物信息学分析
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 引物设计
• 4.3.2 中华绒螯蟹视神经节总RNA的提取
• 4.3.3 中华绒螯蟹性腺抑制激素基因的获得
• 4.3.3.1 RT-PCR扩增性腺抑制激素的片段
• 4.3.3.2 电泳检测并回收片段
• 4.3.3.3大肠杆菌JM109细胞的生长曲线和感受态细胞
• 4.3.3.4载体连接和筛选
• 4.3.3.5 中华绒螯蟹性腺抑制激素基因的鉴定
• 4.3.3.6 测序结果的生物信息学分析
• 结语
• 参考文献
• 图版说明
• 致谢