鲤鱼（Cyprinus carpio L.）外周血白细胞cDNA文库的构建和差异表达基因的筛选

论文摘要

为了研究鲤鱼外周血白细胞差异表达基因的结构、表达和功能,本研究利用HybriZAP-2.1 cDNA文库构建试剂盒构建了鲤鱼正常和有丝分裂原刺激的外周血白细胞cDNA文库。有丝分裂原刺激的外周血白细胞cDNA文库的原始库容量为1.67×106pfu/ml,插入片段长度在0.4×103～3.0×103bp,重组率为98.9%,扩增文库的滴度为6.16×109pfu/ml。正常外周血白细胞cDNA文库的原始库容量为5.79×106pfu/ml,cDNA插入片段大小介于0.4×103～3.0×103bp,重组率为99.4%,扩增文库的滴度为4.22×109pfu/ml。以体外正常培养和有丝分裂原刺激的鲤鱼外周血白细胞为实验材料,用荧光mRNA差异显示技术,共获得92个差异片段,其中87个片段有再扩增产物,经纯化后,与pMD-18T载体连接、转化DH5α,获得60个阳性克隆,序列分析显示24个cDNA序列与基因数据库的已知基因没有同源性,36个基因序列与已知基因序列有一定的同源性,其中有5个与免疫应答有关,它们是C15（C30）、A26、C34、A35、B15克隆,分别编码蛋白酶体激活剂PA28-β亚基、CXC趋化因子、胸腺素、B细胞增强因子、基质金属蛋白酶。用地高辛标记的C15和A26为探针,对有丝裂原刺激的鲤鱼外周血白细胞cDNA文库进行核酸杂交筛选,获得了鲤鱼PA28和IL-8的全长cDNA。实验初步研究了有丝分裂原LPS、PHA和ConA刺激鲤鱼外周血白细胞前后和嗜水气单胞菌刺激前后鳃、肾、脾、肌肉、心、脑、肝组织的PA28亚单位mRNA的表达量变化,旨在研究鲤PA28体内表达的调控机理,分析PA28在鲤鱼MHCⅠ类抗原应答和呈递中的作用机制。对IL-8有丝分裂原LPS、PHA和ConA刺激鲤鱼外周血白细胞前后的mRNA的表达量变化做了分析,旨在阐明鲤鱼IL-8在免疫和炎症过程中的调节机制。Northern杂交显示, IL-8基因经有丝分裂原LPS和PHA刺激后,能在鲤外周血白细胞中表达。Southern杂交结果可以初步断定该基因在鲤鱼基因组内不是单拷贝基因。

论文目录

• 前言
• 第一篇 文献综述
• 第一章 鱼类免疫学研究进展
• 1 鱼类免疫系统
• 2 固有性免疫应答及其调节
• 3 适应性免疫应答及调节
• 4 母源性免疫
• 5 影响免疫应答的因素
• 6 免疫学在鱼病诊断与防治中的应用
• 7 展望
• 第二章 鱼类细胞因子研究进展
• 1 鱼类细胞因子介绍
• 2 细胞因子和鱼类免疫细胞的关系
• 3 鱼类细胞因子和非特异性免疫系统的关系
• 4 鱼类细胞因子研究成果的应用
• 第三章 mRNA 差异显示技术的研究进展
• 1 mRNA 差异显示技术的原理和方法
• 2 模板与反转录反应
• 3 引物
• 4 PCR 扩增条件和参数选择
• 5 电泳与差异条带的显示
• 6 差异cDNA 片段的回收、纯化及再扩增
• 7 差异表达基因的鉴定
• 8 差异cDNA片段的克隆与序列分析
• 9 mRNA 差异显示法的优势与不足
• 10 mRNA 差异显示技术的应用
• 第二篇 研究内容
• 实验一 鲤鱼（Cyprinus carpio L.）正常和有丝裂原刺激的外周血白细胞cDNA文库的构建
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 鲤鱼外周血白细胞分离和体外培养
• 2.2 培养鲤鱼外周血白细胞总RNA的提取和mRNA分离
• 2.3 cDNA 文库的质量鉴定
• 2.4 HybriZAP-2.1 噬菌体文库的体外大量切割
• 3 讨论
• 3.1 酵母双杂交体系及酵母双杂交载体
• 3.2 cDNA 文库的构建
• 3.3 白细胞cDNA文库及免疫应答相关基因
• 4 小结
• 实验二 鲤鱼（Cyprinus carpio L.）正常与有丝分裂原刺激的外周血白细胞光mRNA 的差异显示分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.3 阳性克隆片段的核苷酸序列测定及同源性分析
• 2 结果
• 2.1 总RNA完整性的检测
• 2.2 差异片段的获得
• 2.3 差异条带的再扩增和差异片段测序
• 2.4 差异片段的 BLAST X 同源性生物信息学分析
• 2.5 20 个不同的cDNA 序列和BLAST N 同源性生物信息学分析
• 3 讨论
• 3.1 差异表达基因的分离方法
• 3.2 mRNA 差异显示技术
• 4 小结
• 实验三 鲤鱼（Cyprinus carpio L.）外周血白细胞蛋白酶体激活因子PA28亚单位全长cDNA的筛选与分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 鲤鱼蛋白酶体亚单位激活因子 PA28 的筛选和基因功能分析方法
• 1.3 PA28 在鲤鱼外周血白细胞和组织中的差异表达分析
• 1.4 PA28 的 Northern blot 杂交
• 1.5 PA28 的 Southern blot 杂交
• 2 结果
• 2.1 筛选PA28 cDNA 全长基因的探针制备
• 2.2 筛选 PA28 的结果和序列分析
• 2.3 PA28 分子的功能结构域及同源性分析
• 2.4 不同物种PA28 氨基酸序列的聚类分析
• 2.5 鲤鱼鳃、肾、脾脏、肌肉、脑、心、肝七个组织总RNA 提取结果
• 2.6 鲤鱼外周血白细胞的 RT-PCR 结果
• 2.7 鲤鱼鳃、肾、脾脏、肌肉、脑、心、肝七个组织的的RT-PCR 结果
• 2.8 嗜水气单胞菌 Ahc501 刺激的鲤鱼鳃、肾、脾脏、肌肉、脑、心、肝七个组织的 RT-PCR 结果
• 2.9 PA28 经过嗜水气单胞菌刺激前后组织的mRNA 表达的t 检验分析结果和图像分析结果
• 2.10 鲤鱼外周血白细胞经过 LP 和 ConA 刺激前后的 PA28 mRNA 表达的t 检验分析结果和图像分析结果
• 2.11 PA28 的Northern blot 和Southern blot 杂交探针
• 2.12 鲤鱼外周血白细胞总RNA 的测定结果
• 2.13 鲤鱼外周血白细胞总RNA的电泳结果
• 2.14 PA28 亚单位的 Northern blot 杂交结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 实验四 鲤鱼（Cyprinus carpio L.）外周血白细胞IL-8 全长cDNA 的克隆与分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.3 IL-8 在鲤鱼外周血白细胞中的差异表达分析
• 1.4 鲤鱼外周血白细胞 IL-8 的 Southern blot 杂交
• 1.5 鲤鱼外周血白细胞IL-8 的Northern 杂交
• 2 结果与分析
• 2.1 探针的制备
• 2.2 A26 探针对有丝裂原刺激的鲤外周血白细胞cDNA 文库筛选和序列分析
• 2.3 IL-8 的功能结构域及同源性分析
• 2.4 不同物种 IL-8 氨基酸序列的聚类分析
• 2.5 鲤鱼外周血白细胞IL-8 的 RT-PCR 结果
• 2.6 鲤鱼 IL-8 的 Northern blot 结果
• 2.7 鲤鱼 IL-8 的Southern blot 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 结论
• 参考文献
• 攻博期间发表的学术论文及其他成果
• 中文摘要
• 英文摘要
• 致谢
• CURRICULUM
• 导师及作者简介