论文摘要
背景中枢神经系统血管母细胞瘤（Central Nervous System Hemangioblastoma,CNS HB）是目前神经外科领域治疗较为困难的疾病之一。常伴有其他部位的囊肿或肿瘤,称为VHL病（von Hippel Lindau Disease）,危害更大。迄今为止其组织学起源及发病机制仍不清楚,2000年WHO将其归为来源未定肿瘤,而2007年WHO最新的中枢神经系统肿瘤分类中将其归类于脑膜肿瘤中的其他脑膜相关性肿瘤项目下,具体来源亦不明确。因此,我们对CNS HB进行细胞培养、组织病理学观察、分类功能基因芯片研究及蛋白质组学分析。目的建立CNS HB细胞体外培养的方法,在组织、细胞中筛选CNS HB致病关键因素,为明确其组织学起源、阐明发病机制提供依据。方法1.收集复旦大学附属华山医院神经外科2004年9月至2007年6月手术切除并经术后病理证实的CNS HB组织标本35例及正常脑组织15例,均经得患者本人或代理人的知情同意。2.第一部分研究中对其中13例CNS HB应用Ⅱ型胶原酶联合胰蛋白酶消化法进行原代及传代培养,并通过形态学观察、免疫荧光染色、细胞超微结构观察、培养液上清EPO及VEGF浓度测定对培养细胞进行鉴定。3.第二部分研究中对所有收集的CNS HB及正常脑组织标本进行病理切片、常规H.E.染色及选择性的免疫组化染色,比较HB与对照组各个组成细胞之间对每个抗体的染色阳性率及染色强度的差异以及VHL与NVHL（None-VHL Disease）组之间的染色差异。4.第三部分研究中根据前两部分研究结果,对6例VHL CNS HB、7例NVHL CNSHB及7例正常脑组织混合而成的3份样品以及VHL CNS HB、NVHL NS HB及正常神经细胞（共3株细胞）进行RNA抽提,与SuperArray公司（USA）Oligo GEArray（?）干细胞及缺氧信号通路功能基因芯片分别杂交,比较CNS HB组织与正常脑组织、CNSHB细胞与正常神经细胞、VHL与NVHL组之间的差异表达基因。应用Real-time PCR及RT-PCR对结果进行验证。5.第四部分（一）研究中应用2-DE联合MALDI-TOF-MS的蛋白质组学技术对5例CNS HB组织标本及4例正常脑组织标本进行蛋白质提取、双向凝胶电泳（2-DE）、快速银染、差异蛋白质点的选取和质控措施、切胶及蛋白质酶解、MALDI-TOF-MS质谱鉴定,获得与CNS HB致病相关的差异表达蛋白质,并应用免疫组化、RT-PCR及Western Blot自多个层次验证研究结果。6.第四部分（二）研究中应用2D-HPLC串联LTQ-Orbitrap MS的蛋白质组学技术对CNS HB细胞及正常神经细胞进行蛋白质提取、2D-HPLC色谱分离、LTQ-Orbitrap MS质谱鉴定、Shoutgun法定量,比较并筛选与CNS HB致病相关的差异表达蛋白质,并与CNS HB组织蛋白质组学研究结果比较。结果1.第一部分细胞培养研究中,13例CNS HB组织有11例培养成功。形态学观察细胞呈扁平状短梭形或不规则三角形,类似人骨髓基质细胞（MSCs）以集落方式生长。细胞免疫荧光染色显示CD133+、Nestin+、Vimentin+、VEGF+、EPO+、CD34-、SMA-、GFAP-,提示CNS HB具有干细胞的起源。培养液上清检测发现细胞具有向外分泌VEGF及EPO的能力。2.第二部分组织病理学研究中发现Vimentin、CD117、CD133、Nestin、EPO及EPO-R在CNS HB组织的基质细胞、血管内皮细胞、周细胞中均染色阳性,CD34、FVIIIRA及SMA在CNS HB组织的血管内皮细胞、周细胞中染色阳性,在基质细胞中染色阴性。GFAP在CNS HB三种组成细胞中均染色阴性。VEGF仅在基质细胞中染色阳性,而其受体Flt-1仅在血管内皮细胞中染色阳性。VHL则在CNS HB三种细胞中均染色阳性。VHL与NVHL组比较,EPO及EPO-R的染色强度（强阳性率）在VHL组明显高于NVHL组,差异有高度统计学意义。VHL染色阳性率及染色强度在VHL组均小于NVHL组,但差异无统计学意义。其余抗体的染色阳性率及染色强度在VHL组与NVHL组类似,均无统计学差异。Real-time PCR及RT-PCR验证结果与本研究一致。3.第三部分CNS HB组织与细胞的分类功能基因芯片研究中,人干细胞基因芯片的组织与细胞实验中分别发现8个及2个差异表达基因,其中具有相同趋势的差异表达基因有2个:上调1个ABCG2;下调1个RBPSUHL。VHL组与NVHL组之间均无表达差异。人缺氧信号通路基因芯片的组织与细胞实验中分别发现14个及11个差异表达基因,其中具有相同趋势的差异表达基因有6个:上调4个EPO、VEGF、HIF1α、CAⅨ;下调2个HIF1αI、KHSRP。EPO在VHL组较NVHL组明显上调。Real-time PCR及RT-PCR验证可以重复本研究结果。4.第四部分（一）中,首次应用2-DE联合MALDI-TOF-MS蛋白质组学技术建立了HB组与对照组9例组织样品的分辨率及重复性较好的非混合标本2-DE图谱,经ImageMaster 2D软件分析及质控措施后,确定有效差异蛋白质点共12个,HB组较对照组上调7个点,下调5个点。其中仅在HB组表达3个点,仅在对照组表达3个点,HB组较对照组表达增高4个点,下调2个点。12个有效差异蛋白质点在所有9张图谱上经质谱分析、检索MASCOT数据库及生物信息学分析后,全部鉴定成功。其中鉴定所得差异蛋白质Vimentin与CNS HB的干细胞起源有关;CAⅨ与缺氧信号通路有关;14-3-3可能通过抑制细胞凋亡而激活CNS HB细胞;DAAH的缺失加重了血管内皮细胞的功能障碍,最终导致异常血管网的形成,并可能参与CNS HB的囊变过程。而其他蛋白质亦与CNS HB发病密切相关,以往均未见报道。对鉴定的蛋白质点挑选Vimentin、14-3-3、CAⅨ进行免疫组化染色、RT-PCR及Western Blot验证,与本研究结果完全一致。5.在第四部分（二）中,应用2D-HPLC串联LTQ-Orbitrap MS蛋白质组学技术在CNS HB细胞及正常神经细胞株中分别分离了675及532个蛋白质,并全部鉴定成功。这些蛋白质的功能涉及生物学的多个方面。经过Shotgun法定量后发现差异表达蛋白质628个,占蛋白质总数的70.1%。其中仅在CNS HB细胞中表达358个,仅在正常神经细胞中表达215个,CNS HB细胞较正常神经细胞上调30个,下调25个。结果包括在组织实验中筛选获得的11个与CNS HB发病密切相关的差异蛋白质（Hemoglobin beta chain除外）。另外尚发现其他与CNS HB致病相关的蛋白质如PDGFA associated protein 1与干细胞分化有关;Annexin可能是一个新的临床诊断标志物,值得进一步深入研究。CNS HB细胞与正常神经细胞差异较大,可能具有不同的细胞起源。结论1.建立CNS HB细胞体外培养的方法。发现所培养的细胞是CNS HB基质细胞,具有中胚层间质组织干细胞的起源,可能是一种良性肿瘤的干细胞,在体内特定条件下向血管细胞分化并形成肿瘤实质,最终导致CNS HB的发生。2.揭示缺氧信号通路在CNS HB发病中的重要作用。HIF1α是缺氧信号通路最关键的环节。其在CNS HB中的上调导致其下游基因如EPO、VEGF、CAⅨ、KHSRP等表达异常,最终形成CNS HB。EPO及VEGF通过基质细胞的自分泌与旁分泌机制,促使CNS HB发生。3.首次发现EPO是VHL CNS HB与NVHL CNS HB组织细胞中最主要的差异表达因素,提示EPO在VHL病发病过程中起到更大作用,增加了患者罹患肿瘤的几率。4.应用2-DE联合MALDI-TOF-MS蛋白质组学技术对CNS HB肿瘤组织及正常脑组织进行分析,首次建立具有高分辨率及可重复性CNS HB的2-DE图谱,有效筛选并鉴定12个与CNS HB发病密切相关的蛋白质,其中Vimentin与CNS HB干细胞起源有关;CAⅨ则是缺氧信号通路的重要分子,通过直接损伤及局部缺氧导致CNS HB细胞异常分化;14-3-3可能通过抑制细胞凋亡而激活CNS HB细胞;DAAH的缺失加重了血管内皮细胞的功能障碍,最终导致异常血管网的形成。以往均未见报道。5.应用2D-HPLC串联LTQ-Orbitrap蛋白质组学技术对CNS HB细胞与正常神经细胞进行分析,分别分离675及572个蛋白质,且全部鉴定成功。这些蛋白质的功能涉及生物学的多个方面。包括在组织实验中筛选获得的11个与CNS HB发病密切相关的差异蛋白质（Hemoglobin beta chain除外）。在其他发现的与CNS HB发病相关的蛋白质中,PDGFA associated protein 1与干细胞分化有关,Annexin可能是一个新的临床诊断标志物,值得进一步研究。6.CNS HB的发病是多因素、多步骤参与的复杂过程,本研究发现了多个与其致病相关的基因或蛋白质,为深入研究其组织学起源及发病机制提供充分的依据及恰当的切入点。综合上述结论,本研究发现CNS HB可能具有中胚层间质组织干细胞的起源,EPO、VEGF、HIF1α、Vimentin、14-3-3、CAⅨ、DAAH等是其致病的关键因素。
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