猪骨髓间充质干细胞分离培养及其核移植胚胎发育潜能研究

论文摘要

本实验以不同的方法分离培养了猪骨髓间充质干细胞（pMSCs）,对分离培养的pMSCs生物学特性进行了分析,并以pMSCs为供核细胞进行了核移植实验,通过重构胚的体外发育能力研究了pMSCs的发育潜能;以人骨髓间充质干细胞（hMSCs）与猪卵母细胞构建了人-猪异种重构胚,研究了hMSCs异种重构胚的体外发育能力,同时还对比研究了两种重构胚在激活后的核形态变化。实验取得以下结果:1.以1mg/ml胶原酶消化法分离培养PFs ,和胰蛋白酶消化法相比,可更为有效地解离细胞,一般34d即可达70%～80%细胞汇合,因此可在较短的时间内成功地获取原代PFs。2.本实验采用密度为1.077g/ml的淋巴细胞分层液进行密度梯度离心分离pMSCs ,在同等时间内,相对于全骨髓贴壁筛选法,该方法所获得的贴壁细胞量多,pMSCs相对较纯。3.本实验从形态学及细胞表面分子标记（Vimention和CD106标记呈阳性,而CD45标记呈阴性）来鉴定pMSCs,初步确定所培养细胞为骨髓MSCs。本实验体外培养的pMSCs增殖倍增时间（Td）为36.48h,分裂指数第4d达到峰值为23.6±4.7‰,10h的贴壁率为78.49±6.2%。4.本实验选用了盲吸法对MII期的猪卵母细胞进行去核,去核率为86.0±0.43%。5. PFs与pMSCs重构胚的卵裂率（76.04±8.1% vs 74.45±12.1%）和囊胚率（15.07±2.2% vs 14.63±7.9%）无显著差异,pMSCs重构胚囊胚内细胞数略高于PFs重构胚与PA胚胎（p>0.05）。6.以hMSCs和pMSCs为供体细胞与猪MII期去核卵母细胞进行核移植得到重构胚,并进行胚胎发育能力的比较,在72h之前,两者发育能力没有显著差异;但是在第7d时,hMSCs异种重构胚的囊胚率（3.2±0.7%）显著低于pMSCs重构胚（11.59±2.37%）（p<0.05）。7.实验检测了hMSCs-猪异种重构胚和pMSCs重构胚在核移植激活后的核形态变化过程。激活后2h,有39.39±10.6%的hMSCs-猪异种重构胚染色体处于凝集状态,而pMSCs重构胚为53.49±9.5%（p>0.05）;在激活后6h,有55.26±8.3%的hMSCs-猪异种重构胚形成原核,pMSCs重构胚则为58.18±7.8%（p>0.05）。8.在胚胎发育第5d分别计数了hMSCs-猪异种重构胚各发育阶段的胚胎数。停滞在4-细胞期的hMSCs-猪异种重构胚占28.80±3.9%,而pMSCs重构胚及孤雌胚胎只有13.04±1.1%和14.06±1.5%（p<0.05）。以上结果表明,pMSCs增殖能力强,生物学性状稳定,pMSCs核具备支持早期胚胎发育的能力;与pMSCs核移植胚胎相比较,虽然hMSCs核可以在猪成熟去核卵母细胞中成功进行形态重建,但重建后的核支持早期胚胎发育能力较低,大部分停滞于48-细胞阶段。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 骨髓间充质干细胞（MSCs）的研究概况
• 1.1.1 MSCs 的定义
• 1.1.2 MSCs 的分离与培养
• 1.1.3 MSCs 的生物学特性
• 1.1.4 MSCs 表型鉴定方法
• 1.1.5 MSCs 的体外分化
• 1.1.6 MSCs 应用前景及存在的问题
• 1.2 动物体细胞核移植的研究概况
• 1.2.1 动物克隆技术
• 1.3 影响体细胞核移植效率的因素
• 1.3.1 供核细胞类型对核移植效率的影响
• 1.3.2 供体细胞的细胞周期对核移植效率的影响
• 1.3.3 受体胞质对核移植效率的影响
• 1.3.4 核质相互作用
• 1.3.5 核移植步骤对克隆效率的影响
• 1.4 异种细胞核移植的概况
• 1.4.1 异种细胞核移植的研究进展
• 1.4.2 影响异种细胞核移植相关因素的机理探索
• 1.4.3 动物异种核移植技术的应用前景
• 1.5 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验动物与试剂
• 2.1.2 主要器材
• 2.1.3 主要试剂的配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 猪胎儿成纤维细胞（PFs）的分离培养
• 2.2.2 pMSCs 分离培养及生物学特性测定
• 2.2.3 猪卵母细胞体外成熟培养
• 2.2.4 猪成熟卵母细胞的孤雌激活
• 2.2.5 体细胞核移植
• 2.2.6 体细胞核移植后重构胚核形态的观察
• 2.3 数据处理
• 3 结果与分析
• 3.1 猪胎儿成纤维细胞（PFs）的分离培养
• 3.1.1 PFs 两种原代培养方法的比较
• 3.1.2 PFs 生长曲线的测定
• 3.2 猪骨髓间充质干细胞（pMSCs）原代培养及生物学特性分析
• 3.2.1 pMSCs 两种原代培养方法的比较
• 3.2.2 pMSCs 表面标志测定
• 3.2.3 pMSCs 生长曲线的测定
• 3.2.4 pMSCs 分裂指数的测定
• 3.2.5 pMSCs 贴壁率的测定
• 3.3 PFs 与pMSCs 重构胚发育能力的比较
• 3.3.1 去核效率的检测
• 3.3.2 PFs 与pMSCs 重构胚的体外发育
• 3.4 人-猪异种核移植胚胎发育的初步研究
• 3.4.1 hMSCs-猪异种重构胚的体外发育
• 3.4.2 hMSCs-猪异种重构胚激活后2h 和6h 的核形态
• 3.4.3 hMSCs-猪异种重构胚体外发育阻滞
• 4 讨论
• 4.1 核移植供体细胞的分离培养
• 4.1.1 PFs 的分离培养
• 4.1.2 pMSCs 的分离培养
• 4.2 pMSCs 生物学特性的分析
• 4.3 关于去核
• 4.4 供体细胞类型对核移植效率的影响
• 4.5 供核细胞周期对核移植效率的影响
• 4.6 hMSCs-猪异种重构胚的体外发育
• 4.7 两种供核细胞核移植激活后2h 和6h 核形态的比较
• 4.8 hMSCs-猪异种重构胚体外发育停滞情况
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文