我国部分地区传染性法氏囊病分子流行病学研究

论文摘要

本研究针对近年来我国鸡传染性法氏囊病防制过程中出现的免疫失败现象,对该病的分子流行病学进行了研究。从我国11个省（市、自治区）采集法氏囊病料68份,分离鉴定鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）21株。运用RT-PCR方法对VP2基因进行了扩增、测序、序列分析和遗传进化分析,结果表明:除SH-h株外,其余20株均具有IBDV超强毒株的分子特征,即222A、256I、294I和299S。核苷酸同源性比较表明:分离毒株与欧洲超强毒株UK661和我国超强毒株Gx株核苷酸同源率均在97.5%～99.4%;推导氨基酸同源在98.9%～100%。分离毒株间核苷酸同源率在96.7%～99.9%;推导氨基酸的同源率在98.2%～100%。以UK661为参考毒株,对分离毒株第一亲水区和第二亲水区推导氨基酸比较发现:SH-h株在222位发生A→P替换;HLJ-1、HLJ-2、HLJ-3和HLJ-4在第一亲水区的212位发生D→N替换,HLJ-3和HLJ-4株在第二亲水区321位氨基酸发生A→V替换,且血清I型IBDV均起源于同一祖先序列,所有分离毒株均位于vvIBDV进化群内。遗传距离表明:进化顺序为经典毒株、变异株,最后出现的是vvIBDV。以7株抗IBDV VP2单克隆抗体介导的间接ELISA方法对Gx、HLJ-2株和HLJ-4株3株病毒的抗原性进行分析,结果表明:HLJ-2、HLJ-4和Gx在抗原上存在着一定差异。在此基础上,用HLJ-4株和Gx株对传染性法氏囊活疫苗（Gt株）的免疫保护力进行检验,结果表明:传染性法氏囊活疫苗（Gt株）免疫SPF鸡群能抵抗超强毒株Gx和HLJ-4的攻击,SPF鸡保护率达100%。从山东、甘肃、江苏和辽宁等地的7个鸡场采集349份血清,对禽类三种重要的能引起免疫抑制的病毒（CAV、ALV-J和REV）进行了血清学调查,结果显示:CAV的血清阳性率高达81.4%,表明CAV在我国的一些鸡场普遍存在。为进一步研究CAV感染对传染性法氏囊病疫苗的影响,将80羽1日龄SPF雏鸡随机分为5组,即Gx攻毒对照组（A组）、感染组（B组）、Gt株免疫组（C）、感染-法氏囊活株疫苗（Gt株）免疫组（D组）和空白对照组（E组）,每组16羽,B组和D组在1日龄人工肌注感染病毒CAV-M9905株;7日龄,用鸡传染性法氏囊病活疫苗（Gt株）口服免疫C组和D组雏鸡;14日龄、20日龄和28日龄翅静脉采集分离血清,用ELISA试剂盒检测IBDV抗体水平,在28日龄对A、B、C和D组通过滴鼻点、点眼途径攻IBDV超强毒株Gx（ELD50=102.72/0.1ml）,0.1ml/羽,攻毒后连续观察2周。结果表明:CAV感染使IBDV活疫苗（Gt株）的免疫保护率降低,抗体滴度上升缓慢。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 传染性法氏囊病简介
• 1.2 病原学
• 1.2.1 IBDV 的形态结构
• 1.2.2 IBDV 的分型
• 1.2.3 IBDV 的基因组结构
• 1.2.4 IBDV 基因组编码蛋白
• 1.3 传染性法氏囊病流行病学研究现状
• 1.3.1 流行病学与分子流行病学
• 1.3.2 IBD 的流行病学
• 1.3.3 IBD 分子流行病学的研究现状
• 1.3.4 分子进化树构建常用方法
• 1.4 传染性法氏囊病的诊断及防制
• 1.4.1 诊断方法
• 1.4.2 IBD 的防制
• 1.5 本研究的重要意义
• 第二章 传染性法氏囊病病毒的分离与鉴定
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 主要仪器
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 SPF 鸡胚及试验动物
• 2.1.4 病料采集
• 2.1.5 病料处理
• 2.1.6 病毒分离
• 2.1.7 病毒免疫荧光检测
• 2.1.8 IBDV 基因组RNA 的提取
• 2.1.9 引物设计与合成
• 2.1.10 病毒RT-PCR 鉴定
• 2.1.11 病毒ELD50测定
• 2.1.12 SPF 鸡致死率测定
• 2.2 结果
• 2.2.1 免疫荧光检测结果
• 2.2.2 分离毒株的地理分布
• 2.2.3 病毒的RT-PCR 鉴定结果
• 2.2.4 ELD50测定结果
• 2.2.5 SPF 鸡致死率测定结果
• 2.2.6 发病鸡法氏囊、肝脏、盲肠扁桃体和胸腺的组织病理学变化
• 2.3 讨论
• 第三章 传染性法氏囊病分离毒株的遗传演化分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 主要仪器
• 3.1.2 载体、菌种、工具酶与主要试剂
• 3.1.3 IBDV 基因组RNA 的提取
• 3.1.4 IBDV 基因组的反转录
• 3.1.5 IBDV VP2 基因cDNA 的扩增与克隆
• 3.1.6 IBDV VP2 基因cDNA 序列分析
• 3.1.7 IBDV 遗传进化分析
• 3.2 结果
• 3.2.1 IBDV 分离株VP2 基因cDNA 的克隆
• 3.2.2 VP2 基因序列分析
• 3.2.3 IBDV 遗传演化分析
• 3.3 讨论
• 第四章 分离毒株 VP2 蛋白抗原性差异分析
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 主要试剂及仪器
• 4.1.2 分离毒株VP2 蛋白抗原性差异分析
• 4.1.3 HLJ-2、HLJ-4 和Gx 株同源建模
• 4.1.4 HLJ-2、HLJ-4 和 Gx 抗原性差异检测
• 4.1.5 数据处理
• 4.2 结果
• 4.2.1 分离毒株的抗原差异分析
• 4.2.2 HLJ-2、HLJ-4 和Gx 同源建模结果
• 4.2.3 7 株单克隆抗体介导的 HLJ-2、HLJ-4 株和 Gx 株间接 ELISA 结果
• 4.2.4 数据统计分析
• 4.3 讨论
• 第五章 传染性法氏囊病活疫苗（Gt 株）对 HLJ-4、Gx 株免疫保护试验
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 试验动物、鸡胚、主要试剂及仪器
• 5.1.2 Gx 株ELD50测定
• 5.1.3 动物试验设计
• 5.2 结果
• 5.2.1 Gx 株ELD50
• 5.2.2 死亡鸡胚 IBDV 琼脂扩散检测结果
• 5.2.3 疫苗免疫保护试验结果
• 5.2.4 攻毒死亡鸡IBDV 琼脂扩散检测结果
• 5.3 讨论
• 第六章 鸡传染性贫血病病毒感染对鸡传染性法氏囊病活疫苗 （Gt 株）免疫效果的影响
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 血清采集与抗体检测
• 6.1.2 动物试验设计
• 6.1.3 传染性贫血病病毒PCR 检测
• 6.2 结果
• 6.2.1 CAV、ALV-J 和REV 血清学检测结果
• 6.2.2 CAV 感染后PCR 检测结果
• 6.2.3 IBDV 抗体检测结果
• 6.2.4 Gx 株攻毒结果
• 6.3 讨论
• 第七章 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简历