论文摘要
系统性红斑狼疮（Systemic lupus erythematosus,SLE）是一种累及多器官、多系统的自身免疫性疾病,其患病率高达70-100/10万。如果以全国16亿人口计算,我国的SLE患者已达112-160万之多,且多为年轻女性。其发病机制复杂,临床变化多端,诊治困难,死亡率高。目前治疗SLE的方法很多,首选的治疗方法是糖皮质激素制剂。开始时剂量需较大,以期在1-2周内控制病情,必要时可应用皮质类固醇激素冲击疗法或加用免疫抑制剂治疗。但在皮质类固醇激素和（或）免疫抑制剂治疗过程中,由于用药量大,时间长,容易出现副作用和并发症,如感染（病毒、细菌、真菌等）、诱发糖尿病、消化道溃疡、穿孔或消化道出血、骨折及骨缺血性坏死、精神异常等,很多患者最后死于激素的副作用和/或并发症,严重影响患者的生存期和生活质量。同时,由于上述药物的选择性不理想,部分患者经正规治疗仍不能有效控制病情。大剂量免疫球蛋白冲击疗法、血浆置换疗法以及周身淋巴结照射治疗等,由于未能针对病因治疗,且疗效短暂、费用较高,不能广泛应用。造血干细胞移植治疗虽有令人鼓舞的报告,然而技术条件要求高,价格也甚昂贵,很难普遍推广。因此,SLE的治疗仍是目前国内外公认的医学难题,尚无有效根治方法。1981年BEU-NUN等人在研究由髓磷脂碱性蛋白（MBP）主动免疫诱导的Lewis大鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）时,第一次提出了T细胞疫苗（T cell Vaccine,TCV）的概念。目前国内外学者对一些与T细胞介导有关的自身免疫性疾病（Autoimmune deseases,AID）,器官、组织移植术后进行了T细胞疫苗治疗的实验研究,如类风湿性关节炎（Rheumatoid arthritis,RA）、自身免疫性甲状腺炎、免疫性心肌炎等,都取得令人鼓舞的结果。并且临床上将之应用于治疗RA,也取得了初步疗效。SLE是以T和B淋巴细胞功能异常为特点的自身免疫性疾病,自身反应性T淋巴细胞的活化及由此介导的自身免疫反应是本病发生的中心环节。早在上世纪90年代国外已有学者研究显示,抑制自身反应性T细胞的活性,可降低SLE病情的严重性及延长狼疮鼠的寿命。因此清除自身反应性T细胞可能是SLE又一新的治疗途径。识别自身抗原的自身反应性T细胞,是正常T细胞库的一部分,存在于外周循环中。独特型—抗独特型网络理论认为,在正常机体中,自身反应性T细胞受抗独特型的调节性T细胞的制约,处在数量较少和活性较低的状态,不引起AID,一旦这一免疫自稳状态被破坏,自身反应性T细胞便可活化、增殖并引起病理损害。针对这一理论,用灭活的自身反应性T细胞,诱导机体产生大量的调节性T细胞来抵抗自身反应性T细胞的致病作用,即为TCV的治疗原理,这项治疗措施是目前研究AID治疗的新方向。CD4+CD25+T细胞是一种重要的调节性T细胞,最近越来越多的研究显示,CD4+CD25+T细胞数量及功能异常与许多AID有密切关系,免疫学上目前将CD4+CD25+T细胞视为调节性T细胞的代名词。CD4+CD25+调节性T细胞在SLE中的作用也是目前SLE发病机制的研究热点,多项研究发现,CD4+CD25+调节性T细胞在SLE患者中存在数量减少,或功能异常,与SLE患者病情密切相关。故本实验制备T细胞疫苗,免疫BXSB鼠后,检测CD4+CD25+T细胞,研究TCV对该细胞水平的影响,从而评价T细胞疫苗在SLE治疗上的应用前景。另外,转录因子Foxp3与CD4+CD25+T细胞的关系也是近年研究的热点,国内外多项研究已经证实,Foxp3是CD4+CD25+调节性T细胞的功能相关基因,它作为CD4+CD25+调节性T细胞一个相对特异的标志,它的表达是该细胞发育及发挥功能的前提。有学者研究显示,SLE患者外周血Foxp3的表达下降,同时其表达水平与CD4+CD25+调节性T细胞数量呈依赖关系。所以Foxp3基因的检测及相关分析,也是SLE治疗免疫学上的一个新指标,并有可能揭示TCV的治疗机制。T细胞是在双信号刺激下发生活化和增殖反应的。TCR/CD3复合物与抗体递呈细胞上的MHC结合形成第一信号,进而CD28与相应配体CD80或CD86结合产生共刺激信号,致T淋巴细胞活化从而引发细胞免疫。Salomon B通过给狼疮鼠注射CD28的拮抗剂,发现ds-DNA抗体的产生与CD28-CD86共刺激分子的作用有关,且注射CD28拮抗剂能降低狼疮肾炎的发病率,延长小鼠的寿命。由此可见CD28-CD86共刺激通路在SLE的发病中具有重要的作用。国内有学者研究提示,CD8+CD28+T细胞在SLE患者外周血中表达下降,提示该细胞也可能是反映和监测SLE病情的一个指标。但有关CD8+CD28+T细胞在SLE疾病发生发展中的作用的研究报道甚少。因此本文另一目的是通过检测经TCV免疫的BXSB鼠前后CD8+CD28+T细胞的变化,来分析该细胞亚群在SLE发病中的变化及与SLE病情的关系,以从另一方面揭示TCV的治疗作用。T细胞疫苗在系统性红斑狼疮中的实验研究国内做的不多,本文旨在结合上述SLE发病机制中免疫学方面新的进展,研究T细胞疫苗免疫BXSB鼠后,CD4+CD25+T细胞及相关基因Foxp3,和CD8+CD28+T细胞的变化,来探讨TCV治疗的可能机制和应用前景。目的1.研究T细胞疫苗免疫对BXSB鼠外周血CD4+CD25+调节性T细胞、CD8+CD28+T细胞表达水平的影响,探讨T细胞疫苗治疗SLE的可能机制。2.研究BXSB鼠经T细胞疫苗免疫后基因Foxp3表达的变化,及其与CD4+CD25+调节性T细胞的关系,从基因水平分析T细胞疫苗的可能机制。材料与方法1实验动物2.5月龄BXSB雄性小鼠12只,体重22-27g,北京大学医学院免疫系提供,饲养在南方医院SPF实验室。2方法（1）狼疮鼠T细胞的分离运用目前T细胞疫苗实验研究中常用的提取方法,即从BXSB鼠脾脏提取细胞。一切操作均严格遵守无菌操作及试剂说明书规则进行。（2） T细胞疫苗的制备将提取的脾脏细胞悬液经伴刀豆球蛋白Con A（2.5ug/ml）有丝分裂、增殖,后用丝裂霉素C（25ug/ml）处理细胞,调整细胞浓度备用。（3） T细胞疫苗皮下免疫取1×107细胞皮下免疫,并于首次免疫后第1,2周分别重复免疫。（4）检测:于免疫前,首次免疫后1周、2周和4周分别从尾静脉取血1ml,采用流式细胞术检测CD4+CD25+T细胞、CD8+CD28+T细胞的细胞比例及基因Foxp3表达比率。（5）统计学处理组间CD4+CD25+T细胞、CD8+CD28+T细胞水平及Foxp3比率的比较应用SPSS11.5统计软件处理数据,进行重复测量数据的方差分析,结果中数据以“（?）±s”表示。CD4+CD25+T细胞与基因Foxp3表达水平进行双变量相关分析。结果1 TCV对BXSB鼠外周血CD4+CD25+T细胞的影响1.1 TCV免疫BXSB鼠前后不同时间段内CD4+CD25+T细胞的表达Mauchly球形检验统计量W=0.429,P=0.261本研究显示,不拒绝球形假设,应用单变量检验方法时无需ε（epsilon）校正。TCV免疫前后不同时间段内CD4+CD25+T细胞表达水平差异有显著性意义（F=16.441,P=0.000）。1.2 TCV免疫BXSB鼠后CD4+CD25+T细胞水平与免疫前比较CD4+CD25+T细胞在经TCV免疫后不同时间段均有不同程度的表达,且免疫后该细胞表达水平均值均高于免疫前。其中,免疫后1周与免疫前相比差异无统计学意义（P=0.075）;免疫后2周、4周与免疫前相比差异有统计学意义（P值均为0.000）。1.3 TCV免疫BXSB鼠后各时间段之间的CD4+CD25+T细胞水平的比较TCV免疫后2周、4周CD4+CD25+T细胞水平与免疫后1周相比差异均有统计学意义（P值分别为0.002,0.003）;免疫后4周与免疫后2周相比差异无统计学意义（P=0.559）。2 TCV对BXSB鼠基因Foxp3的影响2.1 TCV免疫BXSB鼠前后不同时间段内基因Foxp3的表达水平Mauchly球形检验统计量W=0.409,P=0.231本研究显示,不拒绝球形假设,应用单变量检验方法时无需ε（epsilon）校正。TCV免疫前后不同时间段内基因Foxp3的表达水平差异有显著性意义（F=15.388,P=0.000）。2.2 TCV免疫BXSB鼠后Foxp3基因的表达水平与免疫前比较基因Foxp3在经TCV免疫后不同时间段的表达均值均高于免疫前。其中,免疫后1周和免疫前比较,二者无统计学意义（P=0.251）;免疫后2周、4周与免疫前相比差异均有统计学意义（P值分别为0.003,0.002）。2.3 TCV免疫BXSB鼠后各时间段之间基因Foxp3表达水平的比较免疫后2周、4周基因Foxp3的表达水平与免疫后1周相比差异均有统计学意义（P值分别为0.004,0.002）;免疫后4周与免疫后2周相比差异无统计学意义（P=0.143）。3基因Foxp3的表达与CD4+CD25+T细胞水平的相关分析经相关分析,Spearmon相关系数rs=0.631,P=0.000（双侧）,即认为基因Foxp3的表达与CD4+CD25+T细胞的水平存在正相关关系。4 TCV对BXSB鼠外周血CD8+CD28+T细胞的影响4.1 TCV免疫BXSB鼠前后不同时间段内CD8+CD28+T细胞表达Mauchly球形检验统计量W=0.498,P=0.375本研究显示,不拒绝球形假设,应用单变量检验方法时无需ε（epsilon）校正。T细胞免疫前后不同时间段内CD8+CD28+T细胞表达水平差异有显著性意义（F=16.172,P=0.000）。4.2 TCV免疫BXSB鼠后CD8+CD28+T细胞水平与免疫前比较CD8+CD28+T细胞在T细胞疫苗免疫后不同时间段均有不同程度的表达,且免疫后该细胞表达水平均值均高于免疫前。且免疫后1周、2周及4周与免疫前相比差异均有统计学意义（P值分别为0.010,0.001,0.001）。4.3 TCV免疫BXSB鼠后各时间段之间的CD8+CD28+T细胞水平的比较免疫后2周、4周CD8+CD28+T细胞水平与免疫后1周相比差异均有统计学意义（P值分别为0.025,0.007）;免疫后4周与免疫后2周相比差异无统计学意义（P=0.074）。结论1.BXSB鼠经T细胞免疫后,可促进CD4+CD25+T细胞、CD8+CD28+T细胞水平的升高,提示T细胞疫苗可影响BXSB鼠体内的免疫状态。这可能是T细胞疫苗发挥治疗作用的主要机制。2.CD4+CD25+T细胞的水平与基因Foxp3的表达呈正相关,提示T细胞疫苗可能从基因水平发挥治疗作用。