MeJA对人参DS基因表达的影响及DS在酵母中的表达

论文摘要

人参是珍贵的药用植物,由于具有显著的药理活性而得到十分广泛的应用。人参的主要有效成分为人参皂苷。至今已从人参中分离出至少60种单体皂苷,除R0外,均为达玛烷型三萜皂苷。而DS负责催化2,3-氧化角鲨烯生成达玛烯二醇,然后经一系列的羟基化、糖基化反应生成各种类型的达玛烷型皂苷。并且对人参DS基因的RNA干扰研究表明,DS基因的沉默导致人参皂苷合成量显著下降,这证明了DS是人参皂苷合成的关键酶,但其具体的调控机制还不清楚。基于以上分析,本论文对DS基因进行了研究。本文首先检测了MeJA对人参发根生长和总皂苷的积累以及5种单体皂苷含量的影响。发现MeJA对人参发根生长和总皂苷的积累及人参皂苷单体Rb1、Rd、Re、Rg2的积累均有明显的促进作用。但是对人参皂苷单体Rg1有明显的抑制作用,且随着浓度的增高,这种积累（或抑制）的作用逐渐减弱。然后利用半定量RT-PCR法检测人参发根DS基因的表达量,发现DS基因的表达量得到提高。以上结果证明了,DS基因表达量的提高能够促进人参皂苷的积累；MeJA的诱导不仅能提高人参皂苷的含量,还能通过影响某些糖基转移酶的表达量来改变人参皂苷单体含量的比例。提取了高质量的人参发根RNA,逆转录合成cDNA,扩增DS基因,建立克隆载体pMD-19T-DS,热转化到大肠杆菌JM109中,通过宝生物测序,发现改变的6个碱基并不引起目的氨基酸编码序列发生改变,证明所克隆的基因为目的基因。利用pAUR123载体构建表达载体pAUR123-DS,并转染酿酒酵母菌（CICC,31476）。利用SDS-PAGE法检测工程菌所表达的蛋白,发现得到85.5kDa的目的蛋白,证明目的基因片段在酵母菌中表达。用HPLC检测酵母代谢产物中达玛烯二醇的含量,发现达玛烯二醇含量较低。最后,检测了工程菌的遗传稳定性,结果证明本实验室构建的工程菌株yeast-pAUR123-DS在无筛选压力下存在质粒不稳定现象。本研究对人参皂苷生物合成调控机制的研究和达玛烯二醇的工业化生产具有重要的指导作用,为调控人参皂苷的含量及人参代谢工程的研究奠定了理论和实践基础,具有广阔的应用前景。

论文目录

• 内容提要
• 第1章 绪论
• 1.1 研究目的、意义及内容
• 1.1.1 研究目的
• 1.1.2 研究意义
• 1.1.3 研究内容
• 1.2 人参皂苷的生物合成
• 1.2.1 人参皂苷生物合成步骤
• 1.2.2 人参皂苷生物合成关键酶基因
• 1.2.3 人参皂苷生物合成调控
• 1.3 植物发根研究进展
• 1.3.1 发根的诱导
• 1.3.2 发根的研究热点
• 1.3.3 人参发根的研究现状
• 1.4 茉莉酸甲酯的研究进展
• 1.4.1 茉莉酸甲酯的化学结构
• 1.4.2 茉莉酸甲酯的功能
• 1.5 半定量RT-PCR技术的研究及应用
• 1.5.1 半定量RT-PCR技术的步骤
• 1.5.2 半定量RT-PCR技术的应用
• 1.6 异源表达系统的选择
• 1.6.1 大肠杆菌表达系统
• 1.6.2 酵母基因表达系统
• 1.6.3 枯草芽孢杆菌基因表达系统
• 1.6.4 昆虫细胞基因表达系统
• 1.6.5 哺乳动物细胞表达系统
• 第2章 MeJA对人参发根皂苷含量的影响
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 人参发根的培养
• 2.2.2 人参总皂苷的提取
• 2.2.3 人参总皂苷含量的测定
• 2.2.4 人参单体皂苷含量的测定
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 人参发根生长曲线的绘制
• 2.3.2 总皂苷标准曲线的绘制
• 2.3.3 总皂苷含量的测定
• 2.3.4 单体皂苷标准曲线的绘制
• 2.3.5 单体皂苷含量的测定
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 第3章 MeJA对人参DS基因表达的影响
• 3.1 实验材料
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 总RNA的提取
• 3.2.2 引物的合成
• 3.2.3 RT-PCR
• 3.2.4 RT-PCR反应条件的确定
• 3.2.5 电泳检测方法
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 人参发根总RNA的提取
• 3.3.2 DS合成酶基因扩增
• 3.3.3 半定量RT-PCR条件的优化
• 3.3.4 MeJA诱导人参发根DS基因的差异表达
• 3.4 讨论
• 3.4.1 RNA提取
• 3.4.2 半定量RT-PCR条件的优化
• 3.4.3 MeJA诱导人参发根DS基因的差异表达
• 3.5 小结
• 第4章 DS基因在酿酒酵母中的表达
• 4.1 实验材料
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 RNA的提取、反转录、PCR
• 4.2.2 PCR产物的回收
• 4.2.3 PCR产物的加尾及纯化
• 4.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 4.2.5 克隆载体的构建
• 4.2.6 大肠杆菌感受态细胞的转化
• 4.2.7 碱法小量提取质粒DNA
• 4.2.8 质粒DNA的酶切鉴定
• 4.2.9 表达载体的构建
• 4.2.10 感受态酿酒酵母的制备
• 4.2.11 酿酒酵母的转染和鉴定
• 4.2.12 酿酒酵母蛋白的提取
• 4.2.13 SDS-PAGE蛋白电泳检测表达产物
• 4.2.14 重组菌遗传稳定性检测
• 4.2.15 达玛烯二醇的提取
• 4.2.16 达玛烯二醇含量的测定
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 克隆载体的酶切和质粒测序
• 4.3.2 测序结果分析
• 4.3.3 表达载体的构建及酶切鉴定
• 4.3.4 酿酒酵母生长曲线的绘制
• 4.3.5 酿酒酵母的转染和鉴定
• 4.3.6 酵母表达蛋白的SDS-PAGE检测
• 4.3.7 重组菌遗传稳定性检测
• 4.3.8 达玛烯二醇含量的测定
• 4.4 讨论
• 4.4.1 克隆载体构建
• 4.4.2 表达载体构建
• 4.4.3 重组工程菌的构建
• 4.4.4 酿酒酵母表达蛋白的检测
• 4.4.5 重组菌遗传稳定性检测
• 4.4.6 达玛烯二醇含量的测定
• 4.5 小结
• 第5章 全文总结与展望
• 5.1 总结
• 5.2 展望
• 参考文献
• 英文缩写
• 攻读博士学位期间发表的学术论文及参加的科研项目
• 致谢
• 中文摘要
• Abstract