论文摘要
动脉粥样硬化（atherosclerosis, AS）性疾病是全球最为严重的疾病之一,对我国也构成严重威胁。其病理变化主要发生在体循环系统的大型弹力型动脉和中型肌弹力型动脉中,是缺血性心脑血管疾病的基础。血小板聚集和血栓形成学说是当今主要的动脉粥样硬化学说之一。该学说强调血小板活化因子增多,使血小板聚集和黏附在内膜上,促进纤维蛋白的交联、聚集和沉着,并且纤溶系统受抑制及各种细胞因子的释放为主要风险因素;促使内皮细胞损伤和增生、LDL浸润、单核细胞聚集、平滑肌细胞增生和游移、成纤维细胞增生、血管收缩、血栓形成等为其病理特征,揭示了血小板活化、黏附、纤维蛋白的交联和聚集在动脉粥样硬化发生发展中的重要地位和作用。葡激酶（staphylokinase, SAK）是一种血纤维蛋白专一性的纤溶酶原激活剂,为136个氨基酸组成的单链蛋白,具有良好的溶栓效果,但作为来自细菌的蛋白,其抗原性限制了其在临床上的应用。RGD（Arg-Gla-Asp）肽序是血小板膜糖蛋白GPⅡb/Ⅲa结合基序,外源RGD肽序通过与Fgn竞争结合活化血小板表面的GPⅡb/Ⅲa,可以抑制活化血小板聚集;另外,水蛭素C末端能结合凝血酶,并阻止凝血酶的作用,发挥抗凝作用。本室前期研究获得了同时引入RGD序列及水蛭素C末端肽段的低抗原性SAK衍生体。并对其进行了表达和纯化研究,制备了大量的纯度高达95%衍生体,并将其命名为瑞心平（RXP）。在上述研究的基础上,本研究对瑞心平在体内、体外的生物学功能进行探索,发现瑞心平是一种具有抗血小板聚集、抑制凝血酶、降解纤维蛋白以及低免疫原性、并具备长期反复使用的优良特性。为了评价瑞心平是否具有干预动脉粥样硬化的药效,我们通过高脂饮食结合免疫损伤的方法建了立大鼠、家兔动脉粥样硬化动物模型,并用大鼠和家兔动脉粥样模型对瑞心平药效进行评价,同时我们还引进了ApoE-/-小鼠模型对瑞心平药效进一步验证发现它能够对抗动脉粥样硬化的形成,保护血管,能够降低血液中的胆固醇含量和改善体内氧化应激状态,并且减少了炎症损伤。提示瑞心平不仅参与了抗凝、溶栓、抗血小板聚集的过程对抗动脉粥样硬化,而且它还调节脂肪代谢和抑制体内炎症,保护血管免于损伤。我们运用基因芯片结合大鼠、家兔和ApoE-/-小鼠的动物模型生化指标和病理特征,验证了瑞心平调节脂肪代谢的功能,并发现了它参与脂肪代谢和改善体内炎症状态的信号分子,初步解释了瑞心平能抑制动脉粥样硬化发展的原因,为瑞心平成为抗AS候选药物提供实验依据。一、瑞心平的活性研究和安全评价利用琼脂糖-纤维蛋白平板溶圈法检测瑞心平及野生型SAK（wtSAK）的溶栓活性,结果证实瑞心平溶栓活性与wtSAK溶栓活性无显著性差异（分别为:3.5±1.4;4.35±0.8）。ELISA证实,瑞心平与wtSAK在同纤维蛋白相结合能力上无显著性差异（P=0.692）,纤维凝块裂解试验同样表明两者溶解凝块能力无明显差异。富血小板凝块裂解试验证实瑞心平裂解富血小板凝块的能力显著高于wtSAK,两者相比较P<0.001;ELISA实验证实,该衍生体结合血小板量随着衍生体浓度增加而增加,并呈现性关系。抗血小板聚集实验说明衍生体SAK具有抗血小板聚集的功能,衍生体与wtSAK比较在抗血小板聚集时具有显著性差异（P<0.001）。凝血酶抑制实验还证实瑞心平具有抑制凝血酶的功效。高剂量（3mg/只小鼠）连续7天注射瑞心平后观察一般动物反应,结果证实小鼠接受瑞心平高剂量注射后无不良反应。二、瑞心平的免疫原性评估及长期使用对凝血/纤溶系统的影响10只猕猴按0.02mg/kg体重剂量,隔天给药,持续两周。停药十周后再次给药,方案与第一次相同。使用ELISA方法检测猕猴血清中抗体水平;并将抗体水平最高给药点的血清与相应药物孵育,溶圈法检测中和抗体;同时观察瑞心平对凝血/纤溶系统的影响。结果表明两组的抗体水平变化趋势相似,但瑞心平组抗体水平显著低于wtSAK组并且瑞心平组猕猴抗体持续时间短。血凝指标PT,APTT,TT和纤溶系统指标FIB,PLG,α2-PI在整个观察期间均无显著变化。通过猕猴试验,我们证实瑞心平抗原表位经过修饰后与野生型SAK相比具有免疫原性低、诱导动物产生量抗体量少,并且抗体持续时间。同时,该药物对凝血/纤溶系统影响小。三、瑞心平干预动脉粥样硬化发展的研究分别用高脂饲料喂养诱发动脉粥样硬化的大鼠、家兔评价瑞心平干预动脉粥样硬化的效果。结果证实瑞心平能够降低大鼠、家兔血浆胆固醇和低密度脂肪酸的含量,还发现反映心血管损伤的一些指标也有所降低。病理切片结果证明,瑞心平能够减少血管的损伤,干预动脉斑块的形成,抑制动脉硬化的进展。用ApoE-/-小鼠进一步对瑞心平药效进行评价,结果同样证实瑞心平能够显著抑制动脉粥样硬化斑块的形成（8周龄生理盐水组斑块面积167589±14213μm2,8周龄瑞心平组斑块面积34056±9925μm2;n=10,P=0.000）;瑞心平能够降低血液中胆固醇和甘油三脂的水平（8周龄生理盐水组胆固醇和甘油三脂含量34.1±15.24mmol/L,2.66±0.60mmol/L;8周龄瑞心平组胆固醇和甘油三脂含量22.804±11.14mmol/L,1.87±073mmol/L;n=10,P<0.05）;减少心血管系统损伤（8周龄生理盐水组CK、CRP分别为768.40±165.1U/L,9.76±6.96mg/L;8周龄瑞心平组CK、CRP分别为267.6±59.70U/L,0.51±0.170mg/L;n=10,P<0.05）。四、瑞心平干预动脉粥样硬化发展的分子基础利用基因芯片对经过瑞心平干预以及未经干预的ApoE基因缺陷小鼠差异基因进行筛选。我们发现:瑞心平对8周龄小鼠动物与未经干预的同一周龄的小鼠比较,获得的差异基因较多;瑞心平对10周龄小鼠进行干预,效率相对较低。从比较结果上我们得出:瑞心平早期干预,能够从脂肪代谢,抑制炎性和氧化等多方面影响动脉粥样硬化发展。8周龄组小鼠所获得总差异基因有2412个,其中涉及脂肪代谢基因有124个,与炎症相关的基因有258个,与氧化应激方面的基因有74个,与血管系统调节相关的基因有58个。而对于10周龄组小鼠,瑞心平的干预效率就相对较低。所获得的差异表达基因总共182个与脂肪代谢调节相关的基因为17个,与炎症相关的基因22个,氧化应激相关基因16个,与血管系统调节相关的基因5个。结论:瑞心平能够干预动脉粥样硬化的发展,可通过溶栓、抗凝、调节血脂代谢、抗氧化反应以及抑制炎症来对抗动脉硬化的发展和恶化。瑞心平具有保护心血管系统,有良好的抗动脉粥样硬化作用,有望进一步开发成为具有独立知识产权的治疗动脉粥样硬化的候选药物。