TNF-α诱导的caspase非依赖性死亡需要Rip3介导的胞内ROS积聚

论文摘要

TNF-α是一种重要的前炎症细胞因子,通过结合膜表面受体TNFRⅠ或TNFRⅡ,发挥其生物学功能,在众多细胞事件中发挥了重要作用。而只有结合带死亡结构域的TNFRⅠ,TNF-α才能诱导细胞死亡。依据具体处理条件和细胞对象的不同,TNF-α能诱导不同类型的死亡:凋亡或坏死。也就是说,TNF-α结合TNFRⅠ后,可以通过多种途径传递死亡信号。目前最为人知的是TNF-α通过TRADD、FADD、caspase-8介导的凋亡性死亡途径,众多caspase家族成员在这一事件中起了重要的作用。而在一些细胞中,TNF-α也能在caspases受抑制的情况下诱导细胞死亡,但如今人们还不十分了解这种死亡方式的信号转导机制。深入研究TNF-α诱导死亡的不同通路,了解它们的差别与关联,不仅可使我们进一步了解细胞死亡的调控机理,还有助于找出一些相关疑难病的治疗方法,为临床实践提供理论依据。本论文以两株NIH3T3细胞作为实验对象。它们在TNF-α刺激下分别通过不同途径传递死亡信号:NIH3T3（R）细胞借助caspases传递凋亡信号;而NIH3T3（S）细胞则通过另一条未知的,不依赖于caspases的信号通路执行死亡事件。由于这两株细胞最初来源是一致的,只是在长期的培养过程发生了自然突变,分化成两株在TNF-α刺激下有着不同表型的细胞,因此可以利用此二者同时研究TNF-α诱导下caspase依赖及非依赖的细胞死亡机制。为了初步探究两株细胞在TNF-α刺激下选择不同死亡途径的机理,我们利用cDNA表达谱芯片分析这两株细胞基因表达的差异,并通过逆转录PCR对差异基因进行验证。最终从众多的差异基因中选择Rip3作为本论文的研究对象,该基因仅在NIH3T3（S）细胞表达,而未在NIH3T3（R）细胞内表达。Rip3属于Rip激酶家族成员,拥有N末端Ser/Thr激酶活性区和独特的C末端,二者间有一个能介导同源相互作用的RHIM结构。现有研究已经表明与Rip3同家族成员Rip1是TNFRⅠ或Trif介导的NF-κB信号通路的重要成员,而Rip3会通过RHIM竞争结合并磷酸化Rip1,抑制NF-κB的激活。另外,有实验表明过量表达Rip3会诱导细胞凋亡,Rip3的C末端正是诱发凋亡的功能区。不过,总的来说,Rip3的功能研究尚处于探索阶段,仍有很多问题有待解决。本论文发现了Rip3的一个新功能:通过介导ROS积聚,传递TNF-α诱导的caspase非依赖的死亡信号。而这一过程的ROS的积聚需要有氧的糖酵解途径。这一发现将有助于进一步了解TNF-α诱导死亡的机制,在实践上则将提升TNF-α的临床应用价值。

论文目录

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• 1 前言
• 1.1 肿瘤坏死因子-α
• 1.1.1 简介
• 1.1.2 TNF-α诱导细胞死亡
• 1.1.3 TNF-α诱导激活NF-κB
• 1.1.4 TNF-α诱导激活MAPK
• 1.2 受体相互作用蛋白家族
• 1.2.1 简介
• 1.2.2 Rip激酶家族成员结构特点
• 1.2.3 Rip1
• 1.2.4 Rip2
• 1.2.5 Rip3
• 1.2.6 Rip4
• 1.2.7 Rip家族其它成员
• 1.3 立题背景
• 2 材料和方法
• 2.1 实验药品和试剂
• 2.2 细胞培养及稳定转染细胞株的筛选
• 2.2.1 细胞培养液的配制
• 2.2.2 细胞培养和传代
• 2.2.3 细胞转染和稳定表达细胞株的筛选
• 2.3 RNA的提取与RT-PCR
• 2.3.1 总RNA提取
• 2.3.2 逆转录合成cDNA
• 2.3.3 小鼠cDNA表达谱芯片检测两株细胞各基因表达情况
• 2.3.4 RT-PCR检测特定基因表达情况
• 2.4 逆转NIH3T3细胞Rip3的表达情况
• 2.4.1 NIH3T3（R）细胞外源高水平稳定表达Rip3
• 2.4.2 NIH3T3（S）细胞的RNA干扰实验
• 2.5 利用流式细胞仪分析细胞存活率、ROS、细胞周期
• 2.5.1 测定细胞存活率
• 2.5.2 测定胞内ROS的积聚
• 2.5.3 测定细胞周期
• 2.6 蛋白质分析
• 2.6.1 蛋白质的SDS-PAGE电泳与Western blot分析
• 2.6.2 溶液配制
• 2.7 细胞内乳酸和ATP水平测定
• 2.8 DNA片段化分析
• 2.9 细胞免疫荧光染色
• 3 结果与讨论
• 3.1 TNF-α通过不同信号通路诱导NIH3T3细胞死亡
• 3.1.1 两株细胞死亡对caspase的不同依赖性
• 3.1.2 抑制caspase足以增强TNF-α诱导的NIH3T3（S）细胞死亡
• 3.2 Rip3在两株细胞中的表达差异
• 3.3 Rip3是TNF-α诱导的caspase非依赖性死亡途径的必要成员
• 3.3.1 下调Rip3的NIH3T3（S）细胞和过量表达Rip3的NIH3T3（R）细胞
• 3.3.2 TNF-α诱导的caspase非依赖性死亡需要Rip3的高水平表达
• 3.4 Rip3参与了TNF-α诱导的ROS积聚
• 3.4.1 ROS在TNF-α诱导的caspase非依赖性细胞死亡中起了重要作用
• 3.4.2 ROS的积聚需要Rip3
• 3.5 糖酵解参与调节caspase非依赖性死亡
• 3.5.1 糖酵解在caspase非依赖的细胞死亡中是必需的
• 3.5.2 mTOR通路不参与调节caspase非依赖的细胞死亡
• 3.5.3 细胞死亡需要的是一条有氧糖酵解途径的参与
• 3.5.4 具有细胞毒性的ROS的生成需要有氧糖酵解途径的参与
• 3.5.5 ATP水平下降和细胞死亡无关
• 3.6 总结与讨论
• 附录一:图表索引
• 附录二:缩略语及中英文对照
• 参考文献
• 致谢