论文摘要
卵巢癌是最常见的威胁妇女生命健康的恶性肿瘤。以手术治疗为主,联合以顺铂为基础的化疗和放疗的综合治疗在卵巢癌的治疗中占有重要地位。长期临床观察证实,80%的卵巢癌患者对以顺铂为基础的联合化疗有效,但其中至少80%最终出现顺铂耐药,化疗耐药性的产生严重阻碍了化疗药物的抗肿瘤效应,使5年生存率徘徊在25%～30%左右,其中以切除修复交叉互补基因（excisionrepair cross complementation group 1,ERCC1）高表达导致的顺铂耐药尤为重要。RNA干扰（RNA interfering,RNAi）是近年来发现的一种有效的基因沉默技术,能特异性地沉默靶基因的表达,在基因功能研究和抗肿瘤治疗方面发挥了重要作用。ERCC1基因表达对保护细胞抵抗化疗药物、放射性损伤等方面均有重要作用,如果不能有效控制腺病毒载体介导的基因转染在正常组织细胞中的表达,则会引起严重的毒副作用。因此,探索一种能有效控制ERCC1 siRNA在肿瘤细胞中特异性表达的调控开关是解决这一问题的关键。端粒酶（tolomerase）是一种特殊的核糖蛋白质复合体,其活化与肿瘤发生、发展及衰老机制密切相关,是细胞癌变中关键的限速步骤。研究发现端粒酶在绝大多数正常体细胞中均为阴性,在生殖细胞及干细胞中呈阳性,但活性较低,在90%以上的永生化细胞和包括卵巢癌在内的恶性肿瘤中均有活性。人端粒酶逆转录酶（human tolomerase reverse transcriptase,hTERT）是端粒酶的限速酶,只在肿瘤细胞中表达,对其调控起决定作用。端粒酶,hTERT,hTERT启动子三者之间密切相关。已证实端粒酶阳性的卵巢癌细胞系中hTERT启动子被特异激活,且其活性与端粒酶活性成正相关。提示hTERT可作为靶向启动子用于端粒酶阳性卵巢癌的基因治疗。本研究在前期工作的基础上,构建带有hTERT promoter和ERCC1 shRNA的重组腺病毒,联合顺铂用药,体外实验观察腺病毒介导的RNA干扰ERCC1基因表达对卵巢癌顺铂耐药的逆转作用,为卵巢癌基因治疗逆转化疗耐药提供新的治疗途径。第一部分pGL3-hTERT promoter-Luc质粒的构建和细胞hTERT promoter活性的鉴定目的:构建带有hTERT promoter的重组质粒,并检测hTERT promoter表达的特异性。方法:1、使用KpnⅠ/HindⅢ分别对质粒pGL3 Basic Vector和包含hTERT promoter的质粒CTS883P-4进行酶切;将hTERT promoter片段亚克隆入pGL3 Basic线性载体;对重组质粒进行酶切鉴定,测序验证。2、用脂质体法分别将重组质粒pGL3-hTERT promoter-Luc、阴性对照质粒pGL3 Basic、阳性对照质粒pGL3 Control转染卵巢癌细胞SKOV3、SKOV3/DDP和脐静脉内皮细胞ECV304,24小时后于荧光显微镜下观察。结果:1、成功构建了带有hTERTpromoter的重组质粒pGL3-hTERT promoter-Luc,经酶切鉴定和测序验证正确。2、转染了重组质粒的SKOV3和SKOV3/DDP细胞能观察到荧光,正常体细胞无荧光;转染pGL3 Basic质粒的卵巢癌细胞和正常体细胞均未观察到荧光。结论:hTERT promoter只在肿瘤细胞中有活性,在正常体细胞中无活性。第二部分携带hTERT promoter和ERCC1 shRNA的质粒表达载体的构建及RNA干扰效果检测目的:构建带有hTERT promoter和ERCC1 shRNA的质粒表达载体。方法:1、构建PMD18 T-hTERT promoter质粒。2、构建pDNR-1r-shRNA表达载体。3、构建pDNR-1r-hTERT promoter-shRNA载体。4、采用脂质体法转染卵巢癌细胞株SKOV3和耐药细胞株SKOV3/DDP,以正常体细胞作对照,观察RNA干扰效果（mRNA水平）。5、在蛋白水平检测ERCC1基因的RNA干扰效果。结果:1、成功构建PMD18 T-hTERT promoter质粒,经酶切鉴定和测序证实插入的外源基因序列正确;2、成功构建pDNR-1r-ERCC1 shRNA表达载体,经酶切鉴定和测序证实插入的外源基因序列正确;3、成功构建pDNR-1r-hTERT promoter-shRNA载体,经酶切鉴定和测序证实插入的外源基因序列正确。4、RT-PCR方法显示,重组质粒转染后24、48、72h,SKOV3细胞内ERCC1 mRNA分别下调（35.02±7.27）%,（49.28±2.46）%,（55.54±2.31）%,（P＜0.01,P＜0.01,P＜0.01）,差别显著;SKOV3/DDP细胞中ERCC1 mRNA的表达分别下调（22.01±8.89）%,（37.30±7.63）%,（42.31±6.90）%,（P＜0.01,P＜0.01,P＜0.01）,差别显著;正常体细胞中ERCC1 mRNA的表达未见明显下调（均为P＞0.05）。5、Western Blot方法检测重组质粒转染后24、48、72h,SKOV3细胞内蛋白水平分别下调（29.76±5.55）%,（52.56±9.83）%,（56.07±10.09）%,（P＜0.01,P＜0.01,P＜0.01）,差别显著;SKOV3/DDP细胞中ERCC1蛋白分别下调（37.83±13.01）%,（59.14±13.68）%,（61.46±12.28）%,（P＜0.05,P＜0.01,P＜0.01）,差别显著;正常体细胞中ERCC1蛋白的表达未见明显下调,分别为（P＞0.05,P＞0.05,P＞0.05）。结论:hTERT promoter只在肿瘤细胞中表达,在正常细胞中无活性,从而避免了采用RNA干扰技术沉默卵巢癌细胞内耐药关键基因ERCC1对正常细胞造成的毒副作用,证实了以hTERT promoter作为调控开关的可行性。第三部分携带hTERT promoter和ERCC1-shRNA的重组腺病毒表达载体的构建目的:构建带有hTERT promoter和ERCC1-shRNA的重组腺病毒表达载体。方法:1、利用同源重组的方法,将重组质粒pDNR-1r-hTERT promoter-shRNA与腺病毒载体在重组酶的作用下进行同源重组。将重组腺病毒载体转化到Ecoli.DH10B感受态细胞中,电转化、植菌、PCR挑选阳性克隆、种植阳性克隆、提质粒、进行酶切鉴定。2、将重组腺病毒载体线性化后,在HEK293细胞内进行包装、扩增,获得高滴度的重组腺病毒。3、同法获得空载体腺病毒。结果:1、成功构建重组腺病毒载体,经酶切验证正确。2、重组腺病毒的滴度为:8×109pfu/ml。3、空载体腺病毒的滴度为:3×109pfu/ml。结论:成功构建了携带hTERT promoter和ERCC1 shRNA的腺病毒表达载体Ad-hTERT promoter-ERCC1shRNA,载体稳定,易于扩增和纯化,病毒滴度高。第四部分腺病毒介导ERCC1 shRNA沉默ERCC1基因对卵巢癌细胞顺铂耐药逆转的体外实验研究目的:在成功构建腺病毒表达载体Ad-hTERT promoter-ERCC1 shRNA的基础上,进行体外实验研究,探讨腺病毒载体介导的RNA干扰沉默ERCC1基因表达对卵巢癌顺铂耐药的逆转作用。方法:1、采用直接感染法,用重组腺病毒感染SKOV3、SKOV3/DDP细胞和正常体细胞,以空载体腺病毒作为对照,采用RT-PCR和Western方法检测感染后细胞内ERCC1基因mRNA及蛋白表达水平的变化。2、重组腺病毒体外感染SKOV3/DDP细胞并联合应用顺铂,采用MTT实验研究感染后细胞对顺铂耐药性的影响,流式细胞计数检测感染后细胞周期及凋亡的改变。结果:1、分别以1,10,50,80MOI的重组腺病毒感染SKOV3细胞,细胞内ERCC1 mRNA表达分别下调（31.91±5.32）%,（42.01±5.34）%,（57.37±11.80）%,（60.49±11.80）%,（P＜0.05,P＜0.01,P＜0.01,P＜0.01）,差别显著;细胞内ERCC1蛋白表达分别下调（17.76±6.71）%,（26.28±3.86）%,（44.67±8.38）%,（48.11±8.50）%,（P＜0.05,P＜0.01,P＜0.01,P＜0.01）,差别显著;空载体病毒感染后细胞内ERCC1 mRNA和蛋白均无明显下调（均为P＞0.05）。2、分别以1,10,50,80MOI的重组腺病毒感染SKOV3/DDP细胞,细胞中ERCC1 mRNA表达分别下调（31.07±3.55）%,（50.67±2.71）%,（63.86±3.63）%,（68.92±1.50）%,（P＜0.05,P＜0.01,P＜0.01,P＜0.01）,差别显著;细胞内ERCC1蛋白表达分别下调（17.43±8.84）%,（27.12±12.40）%,（34.21±15.34）%,（38.11±17.08）%,（P＜0.01,P＜0.01,P＜0.01,P＜0.01）,差别显著;空载体病毒感染后细胞内ERCC1 mRNA和蛋白均无明显下调（均为P＞0.05）。3、重组腺病毒介导ERCC1-shRNA对正常体细胞ERCC1 mRNA和蛋白水平均无明显下调（均为P＞0.05）。4、药敏实验结果显示,以1、10、50、80MOI的重组腺病毒感染SKOV3/DDP细胞后,细胞对顺铂的敏感性分别增加了11.1%（t=9.76,P＜0.05）、16.7%（t=15.07,P＜0.05）、26.4%（t=22.18,P＜0.05）和33.5%（t=24.92,P＜0.05）。
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