论文摘要
目前全球超过8亿公顷的陆地受到不同程度的盐害,这其中包括7%的耕地,其中灌溉系统是诱发土地盐化的主要原因,约有1/3的灌溉土地均受到影响。尽管世界范围内均在大力发展可持续农业的灌溉方式来提高农业生产量,但是这种严峻的盐害形式在未来也不可能完全被消除。大多数农作物都是淡土植物,这就很难在高盐土壤中生长,因此提高作物的耐盐性迫在眉睫,然而因为生理和遗传的复杂性,传统的提高作物的耐盐方式其成效并不理想。分子遗传学和电生理的最新研究进展表明植物维持细胞内高的K/Na比例是抗盐的关键因素,而高K/Na比例的维持基本通过降低组织Na的聚集或者阻止细胞K的流失来实现,更多的学者主要集中于前者机制的研究。随着分子生物学的发展,越来越多的K和Na的通道和载体蛋白被发现,它们吸收和转运机制的揭开为作物提高自身抗盐能力提供了生理基础。目前发现的K/Na转运蛋白基因除离子通道外主要有HAK家族和HKT家族,HAK家族转运蛋白重要负责K的高亲合吸收,而HKT负责Na的低亲合吸收,在这两个家族中,基因功能较为清楚的为数并不多。HAK家族仅在水稻中就发现有26个成员,但只有OsHAKl得以清楚地研究；而HKT家族在水稻中有9个成员OsHKT1:1-1:5和OsHKT2:1-2:4,拟南芥中只有1个成员AtHKT1:1,其中OsHKT2；1和AtHKT1；1均通过其基因的突变体得以详尽地描述。但即使这样,其中的部分功能仍有争议。本文从Na和K的交互作用出发,探讨Na胁迫下K平衡特性和水稻生长特征,并进一步揭示在此过程中起关键作用的载体蛋白基因,并以水稻体内主要吸收Na的HKT家族成员OsHKT2:4为例阐述其生理机制和调控特征。研究结果如下：水稻（日本晴）（Oryza Sativa CV.Nipponbare L.）经正常营养液壮苗30d后,在缺钾和供钾条件下分别用三个外源Na浓度（O mM、25mM和100mM）处理9d,试验结果表明：过量Na极显著地降低水稻根系活性和K的吸收,从而增加根冠比和改变根系形态。但是,9d的缺钾处理并不影响根系形态和根冠比,只在Na过量胁迫下根系活力有所下降。K饥饿极大地促进了Na的吸收并且加强了K从根系向地上部的运输。在基因表达水平上,根系中一个推测为K的转运蛋白OsHAK1在低Na条件下（25mM）诱导表达,但高Na条件下（100mM）又受到显著抑制；叶片在K供应下过量的Na极大抑制其表达。另外一个Na转运蛋白OsHKT2;1的表达在根系和叶片中是受高Na抑制的,但又受饥饿诱导。其他5个K/Na转运基因OsHKT1;1、 OsHKT1;2、 OsHKT2;3、 OsNHX1和OsSOS1的表达不受任何处理的影响,且其中的3个HKT基因都只表达在地上部。这些结果表明OsHKT2;1和OsHAK1在钾钠交互作用下水稻体内K/Na吸收和运输上起着重要的调控作用。HKT家族基因的多数均在根系不表达,而且较为特殊的是OsHKT2;3和HKT家族的另外一个成员OsHKT2;4无论在开放阅读框还是在启动子上都达到了95%的同源性,OsHKT2;3只是在3’端非翻译区有着30bp的差异,所以在上述的基因表达中,无法设计特异性的引物去检测OsHKT2;4的表达情况。鉴于此,利用OsHKT2;4基因的突变体来详细研究这个仅在地上部表达的基因功能。为揭示HKT家族成员的基因功能,从日本国家农业研究院引进水稻（日本晴）OsHKT2;4的TOS17插入突变体的两个株系（TOS17分别插入到该基因编码区的两个不同位点）,用PCR策略在基因组水平上鉴定并筛选了其中的纯合突变体oshkt2;4-1和oshkt2;4-2,并在转录水平上验证了其基因表达的缺失。运用oshkt2;4突变体与野生型水稻（WT）进行低盐和高盐处理的生理试验,突变体和WT在发芽15d后用2mM NaCl处理培养15d结果表明,OsHKT2;4基因的缺失导致水稻根系生长显著受阻,而其体内地上部和根系的Na含量较WT显著增加,并在突变体叶片中检测到与OsHKT2;4高度同源（95.7%）的基因OsHKT2;3表达增强；突变体和WT用正常营养液壮苗30d后添加100mM NaCl并K饥饿处理3d结果显示,oshkt2;4-1和oshkt2;4-2突变体均表现出明显的抗盐特性,生长良好且能显著降低水稻整体组织水平的Na的累积。通过农杆菌介导法转化OsHKT2;3和OsHKT2;4两高同源基因的启动子研究其体内表达模式表明：OsHKT2;3和OsHKT2;4均在地上部微管组织和气孔保卫细胞特异性表达,而在根系不表达,结合两基因的启动子和开放阅读框的生物信息学分析,推测OsHKT2;3和OsHKT2;4可能在水稻体内行使类似的但不能完全互补的生理功能。为探索OsHKT2;4在调控气孔保卫细胞运动上的作用,利用WT和OsHKT2;4两个缺失突变体进行了光合生理比较,采用了正常营养液培养WT和oshkt2;4突变体水稻78d测定了1d中的净光合速率、气孔导度和蒸腾速率,结果显示三者数值在中午时均呈现WT<oshkt2;4;用正常营养液培养75d后,用100mM NaC1处理K饥饿的oshkt2;4突变体和WT水稻3d,发现三个光合指数也呈现相同的结果,但时间出现在上午。由于净光合速率、气孔导度和蒸腾速率均间接反映了气孔的张开程度,因此推测OsHKT2;4是通过调节气孔运动而控制水稻生长的。综上所述,OsHKT2;4通过调节Na在地上部的运输和叶片气孔的运动从而调控水稻的生长,敲除该基因可以增强水稻的抗盐性。