聚谷氨酸高产菌株选育及发酵条件优化

论文摘要

本论文对聚谷氨酸（γ-PGA）检测方法、γ-PGA产生菌的诱变选育、发酵工艺条件进行了研究,同时利用计算流体力学软件对摇床培养过程中的内部流场进行了模拟,主要研究结果如下：（1）发酵液中γ-PGA检测方法的改进γ-PGA发酵液中的成分复杂,在酸解过程中会产生大量的黑色小颗粒,从而严重干扰到γ-PGA的检测。本论文对发酵液预处理和酸解条件进行改进。发酵液预处理：发酵液→离心→上清液→醇沉→重新溶解→二次醇沉→溶解并适度稀释→过滤→预处理液。最适酸水解条件：4mL发酵预处理液加入4mL浓度为6mol/L浓盐酸,密封后在90℃条件下水解16h。（2）紫外线和He-Ne激光复合诱变的研究以地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis） NXTK0001为出发菌株,通过紫外线和He-Ne激光复合诱变结合抗性筛选方法,选育出一株高产γ-PGA的突变株A91,经过摇瓶发酵,产量为16g/L。为出发菌株（产量6g/L）产量的2.67倍。传代试验证明,该突变株遗传性能稳定。（3）发酵培养基优化为了提高地衣芽孢杆菌生产γ-PGA的产量,通过单因素和正交试验确定最佳培养基为（g/L）：葡萄糖80,硫酸镁0.5,酵母水解液20,氯化钠25,硝酸铵4.1,氯化铁0.04,氯化钙0.3,谷氨酸钠80。在此培养基下摇瓶的最高产量可达到22.5g/L,产量提高了40.6%。（4）基于计算流体力（CFD）模拟分析摇床内部流场利用CFD模拟软件对地衣芽胞杆菌摇床培养过程中的内部流场进行预测。通过模拟结果和实验结果的相关性比对,重点考察了摇床位置对γ-PGA产量的关系,确定下层摇床的内侧区域为最适区域。（5）摇床发酵液中γ-PGA提取二工艺的研究建立了从高黏发酵液中分离菌体和γ-PGA的有效方法。具体操作如下：将发酵液酸化至pH3.0,4℃低温下放置24h,虹吸取上清。低速离心彻底除去菌体,旋蒸浓缩后醇析。即得粗品γ-PGA。后经透析袋除去小分子,活性炭除色素和杂蛋白,真空干燥后得到白色γ-PGA,纯度约为80%。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 概述
• 1.2 聚谷氨酸的简介
• 1.2.1 聚谷氨酸的结构
• 1.2.2 聚谷氨酸的理化性质
• 1.2.3 聚谷氨酸的用途
• 1.3 聚谷氨酸的定量检测
• 1.4 聚谷氨酸的合成方法
• 1.4.1 化学合成方法
• 1.4.2 提取法制备聚谷氨酸
• 1.4.3 微生物发酵法
• 1.5 微生物发酵生产聚谷氨酸的主要菌种
• 1.6 γ-PGA的生物合成机理
• 1.7 聚谷氨酸的分离纯化
• 1.8 CFD简介
• 1.8.1 计算流体力学发展概况
• 1.8.2 CFD在工程中的作用
• 1.8.3 FLUENT商业软件简介
• 1.9 本论文的研究意义和研究内容
• 1.9.1 研究意义
• 1.9.2 研究内容
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 主要药品试剂
• 2.1.4 主要仪器设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 培养方法
• 2.2.2 分析检测方法
• 2.2.3 紫外线和He-Ne激光复合诱变复合诱变方法
• 2.2.4 发酵培养基优化方法
• 2.2.5 分离提取方法
• 3 结果与讨论
• 3.1 发酵液中γ-PGA检测方法的改进
• 3.1.1 发酵液中不同组分对γ-PGA酸解的影响
• 3.1.2 γ-PGA酸解条件的优化
• 3.2 紫外线和He-Ne激光复合诱变的研究
• 3.2.1 NXTK0001生长曲线确定
• 3.2.2 诱变程序
• 3.2.3 紫外诱变诱变剂量效应及剂量选择
• 3.2.4 He-Ne激光诱变剂量效应及剂量选择
• 3.2.5 抗性筛选
• 3.2.6 紫外线和He-Ne激光复合诱变
• 3.2.7 诱变菌株的初筛复筛
• 3.2.8 遗传稳定性
• 3.2.9 结论
• 3.3 发酵培养基优化
• 3.3.1 诱变后高产菌A91种子生长曲线
• 3.3.2 单因素培养条件优化
• 3.3.3 正交实验
• 3.4 基于CFD模拟分析某摇床内部流场
• 3.4.1 模拟边界条件和假设
• 3.4.2 模拟模型和控制方程
• 3.4.3 CFD模拟结果
• 3.4.4 摇床发酵培养
• 3.5 γ-PGA的分离提取
• 3.5.1 pH和温度对γ-PGA发酵液粘度的影响
• 3.5.2 乙醇用量对γ-PGA醇析的影响
• 3.5.3 不同pH条件对γ-PGA的醇析的影响
• 3.5.4 干燥方法对醇析样品形成的影响
• 3.5.5 乙醇醇沉法提取γ-PGA的工艺条件
• 4 结论
• 5 展望
• 6 参考文献
• 7 攻读硕士学位期间发表论文情况
• 8 致谢