论文摘要
产毒素多杀性巴氏杆菌（Toxigenic Pasteurella multocida，T+Pm）是猪进行性萎缩性鼻炎（Swine progressive atrophic rhinitis，PAR）的主要病原菌之一。它可以产生一种分子量为146kDa的慢性皮肤坏死性毒素——多杀性巴氏杆菌毒素（Pasteurella multocida toxin，PMT）。该毒素由toxA基因编码，是产毒素多杀性巴氏杆菌重要的毒力因子和保护性抗原。为了分析和鉴定toxA基因中的毒力结构域和免疫原性结构域，本研究主要开展了以下几方面的工作：1．toxA基因及其截短片断的克隆与表达：以本实验室分离保存的产毒素多杀性巴氏杆菌HN-13株为研究对象。首先通过GenBank上已经公布的各种不同株的多杀性巴氏杆菌的基因序列，进行序列分析，找出其中比较保守的部位，分别设计了3对引物，以高保真DNA聚合酶用PCR方法分3段扩增了toxA基因，连接酶连接，得到全长的toxA基因，共3858bp。对获得的全长toxA基因进行基因测序，与GenBank上公布的登陆号为Z28388序列的核苷酸100％同源。然后根据相关文献的报道，对全长toxA基因进行分段截短或连接，共获得9个大小不同的片段，并构建了9个原核表达载体。将各个表达载体转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，其中5个获得了表达，对重组蛋白进行了纯化和Western-blot分析，结果表明：5种重组蛋白均能与HN-13株多克隆抗体发生特异性反应。2．重组蛋白的免疫原性分析：将5种重组蛋白分别用弗氏佐剂乳化，分组免疫昆明小鼠，2周后加强免疫一次，免疫前后用PMT-ELISA检测免疫组和对照组的抗体水平。二免后14天，以1个LD50的HN-13株进行攻击，统计各组小鼠在攻毒后24h和48h的存活率；取各组小鼠的肝脏和肺组织，进行组织病理学分析。结果表明，重组蛋白的免疫保护性从C端截短片段到N端截短片段依次减弱，全长片段有良好的免疫保护力。3．重组蛋白的细胞毒性分析：以小鼠成纤维细胞（NIH-3T3细胞）为材料，实验评估了5种重组蛋白的细胞毒性，观察细胞的死亡数量和病变状况。结果表明，各重组蛋白的毒性较天然毒素有所降低，毒力从C端截短片段到N端截短片段依次减弱。本课题对产毒素多杀性巴氏杆菌toxA基因的功能结构域进行了研究。分段PCR扩增并连接得到了toxA基因的全基因和缺失部分核苷酸的截短片段，分别研究了全基因与截短片段的免疫保护性和毒力，并开展了动物试验和细胞毒力试验。试验表明，截短后的重组蛋白毒力明显下降，具有较好的免疫保护力，为今后进一步研究toxA基因和新型疫苗的开发提供了理论依据。
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标签：产毒素多杀性巴氏杆菌论文; 截短片段论文; 免疫原性论文; 细胞毒性论文;