水稻脆性基因C8的遗传定位

论文摘要

细胞壁生物原料是地球上非常重要的可再生资源,但目前只有2%的细胞壁生物质被利用。水稻是重要粮食作物和单子叶模式植物。其秸秆是丰富的生物质,同时秸秆的机械强度是重要的农艺性状。研究水稻的细胞壁结构和合成调控机理具有重要的理论意义和应用价值。水稻脆秆突变体是研究次生细胞壁合成调控的重要材料。目前已克隆了8个脆秆突变体（bc）基因,初步揭示了单子叶植物细胞壁生物合成和调控的分子机理。本研究对脆秆突变体C8进行了研究。该突变体筛选自日本晴（Nipponbare）的T-DNA插入突变体库,在田间表现为茎秆较脆,而叶片脆性不明显,其它农艺性状正常。利用SSR分子标记,初步将C8基因定位在第8染色体101kb的区段内,该区段尚未见脆秆基因的报道。其主要实验结果如下：1.C8的农艺性状考察和茎秆机械组织结构分析C8除与脆性相关的性状（茎秆折断力和茎秆机械强度）与日本晴有明显差异外,在倒伏指数、茎秆直径和壁厚无明显差异,这可能是该突变体脆而不倒的原因。C8在株高、单株有效分蘖数、单株穗重和生物量等农艺性状方面无明显变化,单株穗重略有减少。荧光增白剂染色日本晴和C8茎秆第二节间徒手切片,没有观察到明显差异；间苯三酚染色表明,C8次生细胞壁厚度比日本晴略有加厚,且染色较深,表明木质素含量升高,但细胞形状不规则,排列松弛,这可能是导致茎秆变脆的主要原因。2.C8的细胞壁成分测定和降解转化效率分析与日本晴相比,C8的纤维素含量略有减少,木质素略有增加,而半纤维素含量增加31.9%。进一步用GC-MS测定单糖成分,鼠李糖,阿拉伯糖,木糖,甘露糖,半乳糖在C8中的含量都比日本晴高；HPLC测定木质素单体成分变化,木质素单体G含量略升高,单体S含量略降低,单体H含量显著降低。3.F2分离群体和遗传分析F2分离群体是C8和明恢63杂交后得来。2010年7月在武汉和鄂州分别种植3个C8/MH63 F2分离群体。在武汉种植群体BP13,群体有180个单株,其中有37个脆秆。鄂州种植群体BB15和BB17,BB15有314个单株,65个脆秆；BB17有770个单株,147个脆秆。BP13,BB15符合孟德尔遗传分离比,BB17略有偏离。选用BB17作为遗传定位群体。4.C8脆性基因的初步定位结果检测200对分布于第3～第9号染色体上的SSR引物,在日本晴和明恢63之间有136对引物具有多态性,多态性比率为68%。构建脆和不脆DNA池,采用BSA法进行基因定位。发现第8染色体上的标记RM6356和RM1376与脆秆性状连锁。用RM6356和RM1376引物进行BB17 F2群体单株验证,并进一步加密SSR引物,将脆秆基因定位于RM5647和RM22942之间,物理图距为10lkb。5.C8候选基因分析在RICE GENOME AMMOTATION PROJECT（http://rice.plantbiology.msu.edu/）网站上检索到在RM5647和RM22942间有16个预测基因,其中LOCOs08g05510.1和LOCOs08g05520.1是MYB家族基因,LOCOs08g05560.1是锌指结构基因,这些基因是否是C8候选基因有待验证。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 1 文献综述
• 1.1 植物纤维素的生物合成
• 1.1.1 植物纤维素的结构
• 1.1.2 植物纤维素合酶基因
• 1.1.3 植物纤维素合成途径
• 1.2 水稻脆杆（bc）突变体研究进展
• 1.2.1 水稻脆秆（bc）突变体研究概况
• 1.2.2 bc基因的克隆和功能
• 1.2.3 水稻脆性（bc）性状在遗传改良中的作用
• 1.3 分子标记技术
• 1.3.1 植物分子标记的种类和比较
• 1.3.2 SSR分子标记技术
• 1.3.3 BSA法在对质量性质的定位
• 1.4 本研究的目的与意义
• 2 材料与方法
• 2.1 供试水稻材料
• 2.1.1 C8来源
• 2.1.2 定位群体材料
• 2.1.3 主要试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 定位群体种植与性质调查
• 2.2.2 细胞壁结构切片观察
• 2.2.3 水稻秸秆细胞壁成分测定
• 2.2.3.1 细胞壁多糖成分提取和测定
• 2.2.3.2 细胞壁木质素含量测定
• 2.2.3.3 比色法测定六碳糖,五碳糖和糖醛酸
• 2.2.3.4 GC-MS测定单糖组成
• 2.2.3.5 HPLC测定木质素单体组成
• 2.2.4 水稻秸秆降解转化效率分析
• 2.2.4.1 生物质稀酸预处理及酶解
• 2.2.4.2 生物质稀碱预处理及酶解
• 2.2.5 水稻DNA的提取（CTAB法）
• 2.2.6 SSR标记PCR体系和扩增程序
• 2.2.7 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法
• 2.2.7.1 凝胶制备
• 2.2.7.2 电泳
• 2.2.7.3 显影
• 2.2.8 基因定位与候选基因预测
• 3 结果与分析
• 3.1 C8的农艺性状
• 3.2 C8茎秆组织细胞学分析
• 3.3 C8和日本晴细胞壁结构和降解转化效率
• 3.4 C8遗传分析
• 3.5 C8基因定位分析
• 3.5.1 SSR多态性分析
• 3.5.2 C8基因初定位
• 3.6 候选基因分析
• 3.6.1 RT-PCR分析OsCesA基因在C8中的表达
• 3.6.2 C8候选基因分析
• 4 讨论
• 2分离群体不符合单基因孟德尔遗传的讨论'>4.1 BB17 F₂分离群体不符合单基因孟德尔遗传的讨论
• 4.2 群体定位SSR标记在11,15单株中都发生交换的现象讨论
• 4.3 BSA法讨论
• 4.4 图位克隆的发展讨论
• 4.5 展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢