论文摘要
趋化运动是一种非常保守的细胞行为过程,代表了细胞感受外界化诱因子的浓度梯度而发生定向运动的能力。肿瘤的转移是癌症患者死亡的主要原因。最近的研究表明,趋化运动在癌细胞转移中起关键作用。表皮生长因子受体（EGFR）作为一种细胞表面重要的受体酪氨酸激酶,对于乳腺癌细胞具有十分有效的趋化诱导效应。但目前对于该信号通路还知之甚少,我们对于EGFR下游趋化运动信号转导机制的研究将有利于癌症治疗和寻找新的有效的药物靶点。在本文中,我首先研究了脂筏在由EGFR介导的乳腺癌细胞趋化运动中的作用。脂筏是细胞膜上一种有序的微区域,可以调节许多膜受体的活化。在本文的研究中,共聚焦显微镜的结果显示EGFR与富含GM1分子的脂筏是共定位的。使用甲基β环糊精（mβCD）破坏脂筏可以抑制EGF诱导的人乳腺癌细胞的趋化运动。当向体系中补加胆固醇后,这种抑制效应可得到部分逆转。mβCD的处理还可以影响伤口愈合实验中细胞的迁移能力,EGF诱导的细胞黏附,肌动蛋白聚合以及Akt、PKCζ分子的磷酸化和移位。因此,我的研究表明脂筏对于EGF诱导的乳腺癌趋化运动是至关重要的。3’磷酸肌醇依赖的激酶1 （PDK1）在很多入侵性癌细胞中都是高表达的。在本研究中,我们主要探索PDK1在癌细胞趋化运动及转移过程中的作用。通过小干扰RNA（siRNA）技术将PDK1蛋白表达水平降低之后,人乳腺癌细胞的趋化运动受到严重地抑制。当转染了野生型PDK1质粒后,该抑制效应得到部分恢复。我们的结果显示,PDK1的降表达影响了EGF诱导的细胞黏附和肌动蛋白聚合能力,这很可能是由于LIMK/cofilin和integrinβ1磷酸化水平分别降低所致。共聚焦显微照片表明PDK1可与Akt、PKCζ在近膜区发生共定位,而这两个分子参与调节LIMK和integrinβ1。另外,PDK1的降表达严重阻碍了EGF诱导的Akt和PKCζ的磷酸化及其在细胞内的移位,说明这两个分子在趋化运动信号通路中处于PDK1分子的下游。在严重免疫缺陷的（SCID）小鼠模型中,我们进行了体内转移实验。结果表明,PDK1降表达的乳腺癌细胞在向肺部转移的过程中出现严重缺陷。因此,我们的研究显示PDK1在癌细胞转移过程中发挥重要作用,并且通过Akt和PKCζ完成对趋化运动的调节。所以,PDK1可以作为一种重要的靶点来研究抗癌新药以阻断转移。在本文中,我们发现EGF还可以诱导A549和H1299细胞发生趋化运动,这两种细胞为非小细胞肺癌（NSCLC）的典型细胞系。Chelerythrine chloride作为所有PKC亚型的抑制剂可以显着地降低肺癌细胞的趋化能力,而传统和新型PKC的抑制剂如G?6976、calphostine C或G?6850均没有明显效果。这说明非典型PKC可能参与了NSCLC细胞的趋化运动过程。EGF可以诱导非典型PKC发生磷酸化和移位,说明在中EGF可以活化PKCζ。使用PKCζ的一种特异性抑制剂-经修饰的假底物可以剂量依赖的方式抑制NSCLC细胞的趋化运动,这进一步证明了NSCLC细胞的趋化运动需要有PKCζ的参与。机理研究表明,PKCζ受到PI3K/Akt的调节。并且,PKCζ通过调节肌动蛋白聚合和细胞黏附介导趋化运动。因此,我们的实验结果显示出PKCζ参与了NSCLC细胞的趋化运动过程,并可以作为新的药物靶点发展抗肺癌转移的治疗学。在肿瘤病人外周血中出现癌细胞可以作为肿瘤已经从原组织扩散出去的早期标志。因此,肿瘤转移的早期发现和早期治疗可以大大提高癌症治疗的疗效。要做到肿瘤细胞转移的早期检测,则需要高灵敏的检测方法,但一般的临床检测手段难以达到。本文中,我们希望能够研发一种高灵敏度和高特异性的乳腺癌转移检测试剂盒,达到5ml外周血中检出2-5个乳腺癌细胞的检测限。于是,我们采用了免疫磁珠与RT-PCR联用的方法。我们在免疫磁珠富集过程中选用了四种特异性一抗,他们相应的抗原均在上皮细胞中有表达。在随后的RT-PCR过程,我们选用了三个基因作为检测外周血中乳腺癌细胞的标志物进行扩增。目前,我们在现有的实验体系中成功地确认了免疫磁珠富集细胞和单细胞RT-PCR联用检测乳腺癌细胞的可行性,并使用该方法通过体外模拟实验做到:从5ml人外周血中检测到约50个乳腺癌细胞,从1 ml人外周血中检测到约30个乳腺癌细胞。在EGF和SDF-1α诱导下,PKCζ可在细胞内重新分布,由胞浆移位至胞膜。基于这种特性,我们建立了一种用于筛选PKCζ活化抑制剂的细胞模型。将转染PKCζ-GFP到人乳腺癌细胞MDA-MB-231中,得到稳定的细胞株PKCζ-GFP/MDA-MB-231。该细胞在如趋化运动、细胞黏附、细胞迁移及PKCζ磷酸化等方面均与MDA-MB-231细胞具有类似的表型。因此,我们可以用PKCζ-GFP/MDA-MB-231细胞代替正常的MDA-MB-231细胞,通过监测PKCζ-GFP的行为间接判断PKCζ的活化情况。PKCζ-GFP的移位通过荧光显微镜可以很容易地直接观察到。能够抑制PKCζ-GFP移位的抑制剂很可能会细胞趋化运动。利用这种快速筛选细胞模型,我们通过两步筛选已经从小分子化合物库中得到了6个有效的化合物。
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标签：转移论文; 趋化运动论文; 表皮生长因子受体论文; 蛋白激酶论文; 磷酸肌醇依赖的激酶论文;