BrdU标记示踪脂肪成体干细胞成骨分化的实验研究

论文摘要

因创伤、肿瘤切除、感染等原因引起的骨缺损和骨不连是骨科临床上常见的问题,也是治疗上比较棘手的问题。近些年来,随着组织工程技术的迅速兴起与发展,试图通过骨组织工程来解决上述问题已逐渐成为研究的热点。骨组织工程技术主要包括种子细胞、支架材料、细胞因子等要素。其中种子细胞的来源是骨组织工程中首先需要解决的问题,并且是保证骨组织工程能够进一步深入发展的前提。获取一种功能良好、来源充足的理想种子细胞已成为目前骨组织工程研究和发展的迫切任务之一。在本课题中,我们选择了一种新型来源的种子干细胞—脂肪成体干细胞。通过用BrdU标记脂肪成体干细胞,体外成骨诱导,然后植入体内,示踪其在体内的分化行为,从而探讨脂肪成体干细胞作为种子细胞在骨组织工程中广泛应用的可行性。目的:从兔脂肪组织中分离出脂肪成体干细胞(ADASCs),体外进行原代及传代培养后,用BrdU进行标记,观察BrdU对ADASCs生长增殖状况的影响,探索BrdU用于标记脂肪成体干细胞的可行性。如果可行,那用BrdU标记ADASCs,体外成骨方向诱导后,植入体内,示踪ADASCs在体内的分化行为,从而探讨ADASCs作为种子细胞在骨组织工程中广泛应用的可行性。方法:1. BrdU体外标记ADASCs从成年新西兰大白兔颈背部成功获取脂肪组织,剥离剪碎后用Ⅰ型胶原酶消化,得到ADASCs。分离培养ADASCs,第三代ADASCs融合约50%时,加入终浓度25μmol/L的BrdU孵育48h,BrdU免疫组化染色,检测标记情况。然后通过显微镜下形态学观察、台盼蓝排斥试验、MTT试验,观测BrdU对ADASCs生长增殖状况的影响。2. BrdU标记示踪脂肪成体干细胞体内成骨分化在确定BrdU可以用于标记ADASCs的基础上,将BrdU标记过的ADASCs体外向成骨方向诱导分化培养,通过碱性磷酸酶Gomori改良钙钴法染色、茜素红钙结节染色、Ⅰ型胶原免疫组化染色鉴定ADASCs成骨分化情况。然后将BrdU标记后诱导分化培养2周的ADASCs与兔松质骨载体(rabbit cancellous bone,RCB)复合,并通过扫描电镜观察ADASCs在RCB上的生长情况,在成骨诱导培养基中共培养7天后,植入ADASCs所属的自体兔肌袋内。分别于4周、8周、12周后取材,切片HE染色观察新骨生成情况;切片BrdU免疫组化染色观察ADASCs在体内的分化及成骨情况,探讨ADASCs作为种子细胞在骨组织工程中广泛应用是否可行。结果:1.BrdU加入ADASCs中孵育48h后,通过细胞爬片BrdU免疫组化染色结果显示:BrdU可以成功标记ADASCs,标记率为(82.3±8.6)%。显微镜下观察BrdU标记后的ADASCs与未标记的ADASCs生长形态基本一致。台盼蓝排斥试验结果显示:BrdU标记后的ADASCs,活细胞率为(94.4±1.5)%;未标记的ADASCs,活细胞率为(95.2±1.2)%;两者并无显著性差异(P>0.05),说明BrdU对细胞的活性基本没有影响。MTT试验结果显示:BrdU标记后的ADASCs与未标记ADASCs在各时间点均无显著性差异(P>0.05),两者的生长增殖趋势基本一致。2.BrdU标记后的ADASCs向成骨方向诱导培养后,碱性磷酸酶Gomori改良钙钴法染色、茜素红钙结节染色、Ⅰ型胶原免疫组化染色结果均呈阳性,说明向成骨方向诱导成功。ADASCs与RCB复合后,扫描电镜观察ADASCs呈良好相容性生长。取材HE染色结果显示:4周无明显成骨,8周及12周有较明确的新骨生成;切片BrdU免疫组化染色结果显示:新骨生成处有染色阳性细胞,说明先前标记的ADASCs植入体内后可以形成新骨。结论:BrdU用于标记ADASCs是完全可行的,并且是比较理想的手段和方法,因此,BrdU完全可以用于标记示踪ADASCs植入体内后的分化行为。ADASCs体外成骨诱导后,植入体内能够继续维持向成骨方向分化,进一步形成新骨。这样就肯定和明确了ADASCs在体内的成骨能力,从而为ADASCs作为种子细胞在骨组织工程中的广泛应用提供了坚实的理论依据。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献回顾
• 正文
• 实验一 BrdU 体外标记脂肪成体干细胞的实验研究
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 实验二 BrdU示踪脂肪成体干细胞体内成骨分化的实验研究
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 小结
• 参考文献
• 个人简历和研究成果
• 致谢