胃肠道间质瘤PDGFRA基因突变的恶性转化及药物敏感性研究

论文摘要

一、目的:通过观察胃肠道间质瘤PDGFRA基因中一个新的突变位点L839P的对中国仓鼠卵巢上皮细胞（CHO）的增殖、凋亡、蛋白表达、裸鼠成瘤性及对伊马替尼敏感性的影响作用,从而明确PDGFRA基因突变在胃肠道间质瘤发生发展中的恶性转化作用以及其对肿瘤的伊马替尼敏感性的影响。二、方法:1、收集25例胃肠道、肠系膜及网膜部位的GIST新鲜标本,抽提基因组DNA,PCR扩增后直接送测序检测PDGFRA基因exon12及exon18突变情况,以期发现新的突变位点;2、将所构建的质粒pcDNA3.1空载体（NP）、PDGFRA野生型（P）、PDGFRAL839P（M1）、PDGFRA D842V（M2）通过脂质体法分别稳定转染CHO细胞,用Western-blot法检测PDGFRA蛋白的表达情况;通过细胞计数描绘细胞生长曲线,流式细胞仪检测细胞周期,Annexin V检测细胞凋亡,从而明确PDGFRA点突变L839P对细胞增殖及凋亡的影响作用;3、将四株稳转细胞分别注射于SPF动物裸鼠背部皮下,饲养于屏障环境中,以转染空载体组及野生型质粒组为对照,观察转染了PDGFRA突变型质粒的CHO细胞的裸鼠成瘤性;4、将PDGFRA突变型质粒（M1、M2）与KIT野生型质粒（W）分别共同瞬时转染CHO细胞,Western-blot法检测KIT的蛋白表达及磷酸化情况,明确共转时PDGFRA突变体对野生型KIT蛋白表达及磷酸化的影响;5、将PDGFRA四株稳转细胞分别与不同浓度伊马替尼共同孵育72小时后,MTT法检测细胞增殖活性;将PDGFRA及KIT野生型及突变型质粒KIT Ins IPYD579（S）与Del 559-560（Po）分别瞬时转染CHO细胞24小时后,各自加入不同浓度伊马替尼共同孵育90分钟后抽提细胞蛋白,Western-blot法检测蛋白表达及磷酸化情况,从而了解该突变体对GIST的伊马替尼敏感性的影响作用。三、结果:1、25例GIST中,检测出一例exon18点突变Y849H,突变导致第849位酪氨酸被组氨酸所取代;exon12突变未检测出。2、四株稳转细胞抽提蛋白Western-blot结果显示转染了PDGFRA野生型（阴性对照组）及突变型（实验组及阳性对照组）的细胞均有PDGFRA蛋白表达,突变型蛋白表达量有所增加;细胞生长曲线显示实验组及阳性对照组较之阴性对照组与空白对照组生长速度加快;细胞周期检测显示各组处于增殖期的细胞比例（S+G2-M）依次为:28.38%（空白对照组）、24.47%（阴性对照组）、43.79%（实验组）、40.89%（阳性对照组）;细胞凋亡检测显示四组的凋亡率分别为1.77%、1.90%、1.45%、1.57%。3、阳性对照组及实验组的稳转细胞接种于裸鼠背部皮下,三周后可见肿瘤生长,镜下显示为上皮细胞样的形态学特征。4、PDGFRA突变型质粒与KIT野生型质粒共转CHO细胞后,磷酸化KIT蛋白表达明显增强。5、四株稳转细胞与不同浓度伊马替尼共同孵育72小时后,加入高浓度伊马替尼的实验组较之阳性对照组、空白对照与阴性对照组细胞增殖明显受抑;PDGFRA野生型（P）及突变型（M1、M2）质粒、KIT野生型（W）及突变型（S、Po）质粒瞬转后与不同浓度伊马替尼共同孵育90分钟后,M1、S、Po磷酸化蛋白表达明显受抑,P、M2与W变化不明显。四、结论:1、本课题检测出的一例PDGFRA外显子18的点突变Y849H位于文献报道的热点位置,但突变的类型有所不同,突变发生率为4%。该病例发生于胃,最大直径为2.2cm,生物学行为表现为低度恶性。2、通过检测质粒NP、P、M1、M2在CHO细胞的表达,从而证实各重组质粒已在CHO细胞稳定转染并表达。3、与转染空白载体及野生型PDGFRA cDNA组的CHO细胞系相比,稳定转染PDGFRA突变体的细胞生长速度明显加快,增殖活性更强,处于增殖期的细胞比例明显较高,凋亡率减少,说明本例GIST中的PDGFRA突变为功能获得性突变。4、含有突变体重组质粒的CHO细胞诱导裸鼠肿瘤生成获得成功,说明本例PDGFRA基因突变对细胞有较强的恶性转化作用,提示PDGFRA基因突变是导致GIST发生的关键机制之一。5、PDGFRA基因突变可使野生型KIT蛋白激活,在无配体存在条件下出现自主磷酸化,提示PDGFRA基因突变引起肿瘤发生的机制除了使PDGFRA蛋白活化外,还可通过激活KIT蛋白引起下游信号转导通路级联反应,从而促进细胞增殖并抑制凋亡,导致肿瘤发生。6、高浓度伊马替尼长时间作用可使包含PDGFRA L839P突变体的细胞增殖明显受抑,而对D842V突变体抑制增殖作用较弱。而在短时间内伊马替尼即可抑制PDGFRA L839P及KIT Ins IPYD579与Del 559-560突变体蛋白的激活,使磷酸化蛋白表达减低。提示PDGFRA L839P、KIT Ins IPYD579及Del 559-560突变体对伊马替尼治疗有效,而PDGFRA D842V对伊马替尼不敏感。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略词表
• 前言
• 第一部分 胃肠道间质瘤中PDGFRA基因突变的检测
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 胃肠道间质瘤中PDGFRA基因突变体的功能检测
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第三部分 胃肠道间质瘤基因突变对伊马替尼敏感性的影响
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 文献综述
• 致谢