α晶体蛋白对大鼠RGCs保护作用及机制研究

论文摘要

【背景】视神经损伤后保护RGCs存活和促进轴突再生的有效途径已成为当前国内外研究的热点。近年,Fischer、Leon及Lorber分别通过离体和在体实验证明:晶状体损伤可激发“神经保护物质”的释放,可以保护RGCs存活、促进损伤的视神经再生。但是,“晶状体源性神经保护物质”是什么?王艳华将提取的大鼠可溶性晶体蛋白作用于离体培养的RGCs,结果证实大鼠晶体蛋白对RGCs的存活和轴突生长有显著的促进作用,其作用显著强于巨噬细胞提取液。大鼠可溶性晶体蛋白有多种成分,为了探讨到底是哪种成分起作用以及避免干扰因素的影响,刘康利用凝胶色谱方法分离大鼠混合晶体蛋白,根据色谱图分别收集各峰相的晶体蛋白组分,通过电泳和质谱分析证明获得蛋白分别为α、β和γ晶体蛋白组分。离体RGCs培养干预实验证实,大鼠α晶体蛋白（α-crystallin）和β晶体蛋白均可促进离体RGCs存活和突起生长,其中α晶体蛋白作用显著。显然,α晶体蛋白不仅仅是一种结构蛋白,它还具有复杂的生物学作用,但是国外对α晶体蛋白对RGCs的作用研究较少,有专家对我们自行分离提纯鼠α晶体蛋白的纯度提出了疑虑,为避免α晶体蛋白纯度上的误差,以及从其最终的临床应用角度考虑,利用人类自身来源的α晶体蛋白显然不是很现实,而大鼠来源的α晶体蛋白还必须考虑到其成本,那么,来源容易、成本又低的大动物（牛、猪等）α晶体蛋白就在应在考虑之中,但是,异种α晶体蛋白是否有明确的RGCs保护及促轴突生长作用呢?它是如何起作用的呢?α晶体蛋白分子,无论是其分子本身或分解成20KD大小的亚基都不可能通过细胞脂质膜,那么,RGCs膜上是否存在与之结合的相关蛋白?其基本信息如何?α晶体蛋白分子是只特异性地作用于RGCs还是对别的细胞也有相似或其它作用方式呢?这些都有待明确。【目的】采用从国外公司购买的纯品牛α晶体蛋白与自行分离提纯的鼠α晶体蛋白作对照,研究牛α晶体蛋白、鼠α晶体蛋白对RGCs的促突起生长作用,在此基础上,进一步观察纯品牛α晶体蛋白对脂质过氧化损伤状态下大鼠RGCs的影响,并对α晶体蛋白与RGCs的作用物质通过多层面进行亚细胞定位,并以其它类型细胞（巨噬细胞、猪视网膜色素上皮细胞、293细胞株、心肌细胞、ECV细胞株）作对照,观察α晶体蛋白是否只对RGCs起作用。最后分析α晶体蛋白在RGCs上作用的靶物质信息,以期揭示α晶体蛋白对RGCs作用的机制,同时探索牛α晶体蛋白异种来源,为研发视神经损伤修复的新途径提供实验依据。【方法】原代培养Long Evans大鼠的RGCs,Thy1.1免疫荧光法鉴定并进行纯度检测。1、牛及鼠α晶体蛋白促大鼠RGCs生长作用的观察:将牛α晶体蛋白(10-7、10-6、10-5、10-4g/L)和鼠α晶体蛋白(10-4g/L)加入正常培养条件下的RGCs,3、12h、1、2d和3d在相差显微镜下观察RGCs形态学变化;计突起数目、轴突长度。设对照组（不加α晶体蛋白）。2、牛α晶体蛋白对RGCs过氧化损伤的保护作用及机制研究:分为对照组、损伤组、α晶体蛋白组(牛α晶体蛋白10-4g/L)。检测指标:RGCs存活率、RGCs培养上清液中相关酶[超氧化物歧化酶/SOD、乳酸脱氢酶/LDH]活性及丙二醛/MDA水平的变化;Fluo-3/AM荧光比值成像技术测定RGCs胞浆游离钙离子水平;免疫荧光法检测AKT表达及变化、蛋白免疫印迹法检测AKT表达及变化。3、α晶体蛋白与鼠RGCs结合物质的探索实验研究:应用免疫细胞化学染色、免疫荧光激光共聚焦扫描技术、免疫电镜观察牛α晶体蛋白、鼠α晶体蛋白在RGCs上的亚细胞定位。再以免疫印迹实验和质谱方法对牛α晶体蛋白与RGCs作用物质进行分析研究。4、牛α晶体蛋白与其它细胞作用的免疫荧光观察:免疫荧光法观察牛α晶体蛋白与几种类型细胞（巨噬细胞、猪视网膜色素上皮细胞、293细胞株、心肌细胞、ECV细胞株）的作用。【结果】1、Thy1.1鉴定RGCs纯度为90%～95%。2、正常培养条件下α晶体蛋白对RGCs的作用:α晶体蛋白组RGCs突起数目及轴突长度显著大于对照组,以10-4g/L组变化最显著,牛α晶体蛋白、鼠α晶体蛋白无显著差异。3、牛α晶体蛋白(10-4g/L)对过氧化损伤RGCs的作用:与对照组相比,损伤组部分RGCs突起断裂、胞体回缩呈圆形,部分细胞脱落或崩解成碎片,贴壁细胞数量减少,形态也欠佳;细胞存活率显著降低;胞浆钙离子浓度显著升高;RGCs培养上清液SOD活性显著降低,MDA、LDH水平显著升高。RGCs的AKT表达水平显著降低。α晶体蛋白组RGCs形态基本无变化,胞体呈球形或椭圆形,细胞突起清晰可见,细胞贴壁良好,突起回缩、贴壁细胞脱落及破裂现象较损伤组少;细胞存活率显著高于损伤组,与对照组较接近;胞浆钙离子浓度显著低于损伤组,2d时与对照组水平相近;RGCs培养上清液SOD活性及RGCs的AKT表达水平显著高于损伤组;MDA、LDH水平显著低于损伤组,均在2d时接近对照组水平。4、α晶体蛋白与RGCs作用的亚细胞定位研究结果:免疫荧光共聚焦显微镜、免疫组化染色检测证实RGCs与牛α晶体蛋白、鼠α晶体蛋白作用后均在RGCs膜上有“戒指”状免疫复合物沉积,而对照组未见免疫复合物沉积。免疫电镜证实牛α晶体蛋白组RGCs膜上有“线”状免疫复合物沉积,对照组阴性。5、免疫印迹实验及肽质量指纹质谱结果:α晶体蛋白组的PVDF膜上有一个34-43KD之间的特异性条带存在,将其在蛋白质数据库结果分析吻合率较高的蛋白,列出的20种可能结果中有2种评分大于系统显著性评价的标准,检索蛋白质数据库二种评分所对应的为同一种蛋白。6、外源性α晶体蛋白与293细胞、ECV细胞、视网膜色素上皮细胞、心肌细胞以及巨噬细胞的免疫荧光染色试验结果提示:其中前2种阳性免疫沉积物出现在细胞膜上,其对照组阴性;后3种细胞见实验组和对照组均有阳性免疫沉积物出现在细胞浆、细胞核中。【结论】1、牛α晶体蛋白可以显著促进大鼠RGCs突起生长,最佳浓度为10-4g/L。用凝胶色谱的方法获取的鼠α晶体蛋白与国外公司购买的纯品牛α晶体蛋白对RGCs的生物学效应是一致的。2、牛α晶体蛋白可以对RGCs过氧化损伤起保护作用。其机制与减轻过氧化损伤状态下RGCs胞内Ca2+上升水平、脂质过氧化反应以及上调RGCs胞内AKT信号通路的活性有关。3、牛α晶体蛋白、鼠α晶体蛋白均能够与RGCs发生结合作用,其靶点定位在RGCs膜上,这在α晶体蛋白对RGCs保护作用及其机制中可能起重要作用。4、牛α晶体蛋白在RGCs膜上有结合靶物质存在,这种物质与目前一种已知的大鼠蛋白的相似性达到有意义的标准,但α晶体蛋白在RGCs上的靶物质是否确切为此蛋白,还需要进一步验证。5、α晶体蛋白不是特异性地只与RGCs发生作用,它是广泛存在的生物学效应物质。α晶体蛋白在不同细胞中有不同表现形式,有的细胞表达内源性α晶体蛋白,有的细胞不表达内源性α晶体蛋白。6、α晶体蛋白具有sHSP的抗应激损伤特性,对于不表达内源性α晶体蛋白的同时又是抗损伤能力较弱的RGCs,可通过增加外源性α晶体蛋白达到有效保护RGCs的目的。

论文目录

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• 英文摘要
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• 论文正文 a晶体蛋白对大鼠RGCs保护作用及机制研究
• 前言
• 第一部分 牛及鼠a晶体蛋白促大鼠RGCs生长作用的观察
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第二部分 牛a晶体蛋白对RGCs过氧化损伤的保护作用及机制研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第三部分 a晶体蛋白与RGCs结合物质的探索实验研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第四部分 牛a晶体蛋白与其它细胞作用的免疫荧光观察
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 全文总结
• 致谢
• 参考文献
• 文献综述一 a晶状体蛋白研究进展
• 参考文献
• 文献综述二 胶质细胞对中枢神经损伤后再生的影响
• 参考文献
• 在读期间发表的文章