蝉蜕诱导球孢白僵菌产孢相关蛋白质差异表达分析

论文摘要

球孢白僵菌是一种广谱性虫生菌,具有主动感染寄主、能形成循环侵染和寄主难以产生抗性等优点,正得到越来越多的关注,但存在击倒害虫时间长和防效不稳定等缺点,限制了它的进一步应用。为了改变这一局面,各国科学家纷纷致力于球孢白僵菌致病分子机理和遗传学研究,力图从基因水平揭示致病机理,通过基因工程技术提高菌株毒力。关于球孢白僵菌致病分子机理的研究大多从毒素、致病基因等方面进行研究,很少从蛋白质组学方向进行分析,本研究采用蝉蜕诱导球孢白僵菌,分析相关蛋白质差异表达,试图找到毒力相关蛋白。本研究建立了球孢白僵菌双向凝胶电泳技术方法:通过三氯乙酸/丙酮法提取球孢白僵菌总蛋白质,能有效去除其中的白僵菌菌体多糖等杂质;采用Model 680酶标仪按Bio-Rad操作手册测定蛋白质浓度,并用SDS-PAGE电泳检测其质量,获得的蛋白质质量质量较好。进行双向电泳时,将获得的蛋白质用硫脲尿素裂解液（0.5 M Tris-HCl pH 8.3,2%（v/v）Nonidet P-40,20 mM MgCl2,2%（v/v）β-mercaptoethanol,1 mM PMSF）处理,摸索出适合蛋白质样品通过再水化进入IPG干胶条内的条件,采用了50V/小时聚焦,从电泳图谱可以看出低电压较长时间电泳可以更有效的分离蛋白质;第二向SDS-PAGE电泳,我们通过有效手段,避免凝胶发生扭曲现象;凝胶染色我们采用银染法,电泳条带清晰、分离效果好、灵敏度高、不对质谱鉴定产生干扰。双向电泳胶片通过PDQuest软件分析获得约750个蛋白质信息点。通过蛋白质差异表达分析,有38个蛋白质表达量发生2倍以上改变,其中18个蛋白质表达量上调,20个蛋白质表达量下调,2、8、9号为特异表达下调蛋白,22号为特异表达上调蛋白,这说明在蝉蜕诱导球孢白僵菌的过程中,表达调控体系发生了复杂的变化,一些基因被关闭,一些基因被诱导。通过对38个蛋白质点的质谱（MALDI-TOF-MS）鉴定分析,26号蛋白质点为产孢相关蛋白,为上调蛋白,与球孢白僵菌产孢过程相关,推测它在孢子形成过程中的有丝分裂和减数分裂时期起作用;19和39号为尿嘧啶DNA糖基酶,为上调蛋白,与DNA复制、结合和修复有关,推测与孢子形成也有相关性;还有其它蛋白质得到鉴定,其中有DNA复制结合修复、能量代谢、转录调控蛋白质、蛋白质结构域等,推测其中一些蛋白质在孢子产生形成过程中可能起到直接或间接作用。通过对蚕蜕诱导表达的蛋白质分析,本研究获得了与球孢白僵菌毒力相关的蛋白数据,为蛋白水平阐述致病机理提供理论依据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1.1 白僵菌概述
• 1.1.1 白僵菌形态特征及生物学特性
• 1.1.2 白僵菌致病机理
• 1.1.3 白僵菌入侵过程中相关酶的研究
• 1.1.4 球孢白僵菌的生物防治及问题
• 1.1.5 影响白僵菌致病性的因素
• 1.2 球孢白僵菌分子生物学研究进展
• 1.3 蛋白质组学研究进展
• 1.3.1 蛋白质组学的产生
• 1.3.2 蛋白质组学研究的内容及意义
• 1.3.3 蛋白质组学研究技术
• 1.4 本研究的目的与意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验试剂
• 2.1.3 实验仪器
• 2.1.4 实验主要缓冲液配方
• 2.1.5 实验培养基
• 2.2 方法
• 2.2.1 材料的培养
• 2.2.2 样品蛋白质的提取
• 2.2.3 第一向等电聚焦
• 2.2.4 第二向SDS-PAGE
• 2.2.5 凝胶染色
• 2.2.6 凝胶图像上蛋白质点的采集与分析
• 2.2.7 差异蛋白质点的肽质指纹质谱（PMF）分析
• 第三章 结果与分析
• 3.1 材料培养
• 3.2 双向凝胶电泳技术的建立
• 3.2.1 球孢白僵菌总蛋白的提取
• 3.2.2 等电聚焦过程对双向电泳的影响
• 3.2.3 第二向SDS-PAGE电泳对双向电泳的影响
• 3.3 诱导处理组与对照组总蛋白2DE图谱比较
• 3.4 差异蛋白质点MALDI-TOF-MS分析
• 第四章 讨论
• 4.1 蛋白质组学方法的建立
• 4.1.1 双向电泳方法的建立
• 4.1.2 双向电泳凝胶图谱的分析
• 4.2 相关蛋白质分析
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简介