阳离子聚合物PC偶联小分子药物协同基因的抗肿瘤活性研究

论文摘要

目前,化学药物治疗仍是治疗恶性肿瘤必不可少的治疗方法。但抗肿瘤药物的严重毒副作用,水溶性低和无靶向性等缺点,限制了其临床应用。随着许多新型高分子材料在现代医药学的迅速发展,高分子材料作为抗癌药物载体不仅可以在很大程度上增强药物的水溶性,提高药物生物利用率,减少用药次数,还可以有效控制药物在体内的释放速度。虽然在抑制肿瘤生长上取得了良好的效果,但同时也发现连续使用小分子药物治疗的过程中会产生肿瘤耐药性问题。随着分子生物学手段的发展和完善,研究发现将人的正常基因或有治疗作用的外源基因通过一定方式导入人体靶细胞内进行有效表达,纠正基因缺陷,可达到治疗癌症的目的,因此,基因治疗成为当前根治癌症的有效手段。为避免基因治疗过程中出现的免疫原性等问题,基因治疗与其它方法,如外科手术,放射治疗,化学治疗和介入治疗等有机地结合应用,不仅可以克服化学药物的肿瘤耐药性问题,还可以产生协同增效作用,发挥综合治疗的优势。本文的目的在于使用合成的具有基因高转染效率的阳离子聚合物PC作为载体,通过化学偶联方法将小分子抗癌药物键合在高聚物主链上,在降低其毒副作用,提高生物利用率,通过静电作用与治疗基因质粒结合在肿瘤原位部位进行基因表达,产生与药物的协同增效作用,从而达到抑制肿瘤生长的目的。首先β-环糊精上（CD）的活泼羟基用N,N’—羰基二咪唑（CDI）活化,再与低分子量的聚乙烯亚胺（PEI 600Da）偶联,形成一种具有低毒,良好生物相容性,高转染效率且可生物降解的聚合物（PC）氟尿苷（FdUrd）是新近发展的5-氟尿嘧啶（5-Fu）的前体药物,是5-Fu的核苷在糖上5’位脱羟基而成的。已往的氟尿嘧啶药物在服药后,主要由肝脏的药物代谢酶或是自然分解转换成5-Fu的,而FdUrd的特点是由在肿瘤组织中显示高活性的嘧啶核苷磷酸化酶（PyNpase）转换成5-Fu而发挥作用。为减少口服或静脉注射FdUrd药物给正常机体组织带来的毒性,采用将FdUrd通过可生物降解的肽键偶联于高分子载体PC的主链上,控制原料的投料比,合成一系列不同含量FdUrd的高分子前体药物FPC。通过质子核磁共振光谱（1H NMR）,紫外（UV）,凝胶实验,粒径,Zeta电势和药物的降解实验确定物理化学特性；通过MTT细胞毒性实验确定了FPC可有效地抑制神经胶质瘤的增长,细胞摄取实验证明FPC具有较高的生物药物利用率并可快速被细胞吸收,利用模仿肿瘤术后伤口用药实验（细胞划痕、迁移和侵袭实验）发现FPC药物可有效抑制C6细胞的转移。通过流式细胞仪测定C6细胞经FPC药物作用后的凋亡程度和细胞周期的变化。用FPC携带pEGFP和Luciferase基因质粒转染C6神经胶质瘤考察用高分子载体PC同时携带药物与基因作用于同一细胞或组织的可能性,在肿瘤原位注射结合了pEGFP质粒的FPC证明了FPC可携带基因可在体内进行高表达。该研究的意义在于将肿瘤部位直接注射结合基因质粒的FPC,不仅可以有效提高药物的生物利用度,降低机体其他部位的药物毒性,延长药物在肿瘤部位的缓释作用时间,还可以利用FPC携带的抑制或凋亡基因对肿瘤进行进一步的治疗。但随着多种化疗药物的广泛应用,肿瘤的耐药性问题越来越突出,已成为癌症有效治疗的主要障碍之一。临床虽然采用联合多种化疗药物来抑制肿瘤增长,克服肿瘤的耐药性,但对某些癌症,如乳腺癌,肺癌等还是会产生多药耐药性的问题,为解决这一问题,我们采用高分子载体PC偶联小分子抗癌药物-阿霉素（Dox）同时结合p53治疗基因考察对于耐药性乳腺癌的联合增效抑制作用。将Dox通过化学方法偶联于高分子载体PC的主链上,通过控制原料的投料比,合成一系列不同含量Dox的高分子前体药物PC-Dox。通过质子核磁共振光谱（1H NMR）,紫外（UV）,凝胶实验,粒径,Zeta电势等实验确定物理化学特性；通过MTT细胞毒性实验确定了PC-Dox在48h内可有效地抑制乳腺癌细胞增长,细胞吸收实验证明PC-Dox具有高的生物药物利用率并可快速被细胞吸收,用PC-Dox携带pEGFP和Luciferase基因质粒考察PC-Dox作用于乳腺癌细胞上的基因转染效率。通过RT-PCR和Western blot实验考察PC-Dox结合p53基因质粒转染乳腺癌细胞后的多种蛋白的增效表达效果。在确定药物与基因结合的最佳比例后,在裸鼠Balb/c上进行乳腺癌肿瘤的原位注射PC-Dox/p53溶液考察45天内裸鼠的成活率,鼠重及瘤重的变化。结果显示,该方案可对耐药性乳腺癌肿瘤的增长有明显的抑制作用,延长小鼠的成活期,有效降低药物对小鼠心脏产生的毒副作用。以上研究结果均表明,阳离子聚合物PC是一种优良的药物和基因载体,可同时携带药物和基因作用于同一细胞或组织中,通过小分子药物的缓释作用达到术后有效抑制肿瘤的再生与转移,而治疗基因则可有效克服肿瘤耐药性的问题并产生协同化疗药物高效抑制肿瘤的效果。因此,本研究成果在临床癌症治疗上具有重要意义。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 中英文对照表
• 目录
• 第一章 绪论
• 1.1 引言
• 1.2 高分子药物递送系统
• 1.3 高分子药物载体
• 1.4 当前肿瘤的化学治疗存在的问题
• 1.5 基因治疗
• 1.5.1 基因治疗概念
• 1.5.2 基因治疗载体
• 1.5.2.1 聚乙烯亚胺
• 1.5.2.2 多聚赖氨酸
• 1.5.2.3 嵌段共聚物
• 1.5.2.4 环糊精
• 1.6 药物基因联合治疗
• 1.7 本课题的提出及创新点
• 1.8 参考文献
• 第二章 FPC的合成及对神经胶质瘤的抗肿瘤活性的研究
• 2.1 前言
• 2.2 材料与仪器
• 2.2.1 材料和试剂
• 2.2.2 细胞、动物及工作溶液
• 2.2.3 仪器
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 阳离子聚合物PC的合成
• 2.3.2 FPC的合成
• 1H-NMR）'>2.3.3 质子核磁共振波谱法（¹H-NMR）
• 2.3.4 紫外分光光度检测（UV）
• 2.3.5 FPC/DNA复合物的制备
• 2.3.6 粒径和电位测定
• 2.3.7 扫描电子显微镜观察
• 2.3.8 琼脂糖凝胶电泳
• 2.3.9 质粒的提取
• 2.3.10 FPC体外细胞毒性实验
• 2.3.11 H&E细胞染色实验
• 2.3.12 细胞划痕、迁移和侵袭实验
• 2.3.12.1 C6细胞的体外划痕实验
• 2.3.12.2 C6细胞的体外迁移实验
• 2.3.12.3 C6细胞的体外侵袭实验
• 2.3.13 FCM的细胞凋亡和细胞周期实验
• 2.3.13.1 Annexin-Ⅴ染色检测细胞凋亡
• 2.3.13.2 PI染色检测细胞周期
• 2.3.14 FPC的细胞摄取研究
• 2.3.15 FPC体外细胞转染
• 2.3.15.1 聚合物与质粒DNA的复合物对细胞转基因试验
• 2.3.15.2 荧光素酶的测定（使用荧光素酶检测试剂盒）
• 2.3.15.3 细胞裂解液的总蛋白测定
• 2.3.15.4 共聚物/DNA复合物转染的最佳N/P比值的确定
• 2.3.15.5 细胞转染pEGFP质粒后的绿色荧光的观察
• 2.3.16 FPC瘤内基因转染实验
• 2.3.17 数据的统计学处理
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 PC和FPC的合成
• 2.4.2 质子核磁共振图谱分析
• 2.4.3 紫外分光光度检测
• 2.4.4 琼脂糖凝胶电泳
• 2.4.5 粒径、电位表征及透射电镜观察
• 2.4.6 MTT细胞毒性实验
• 2.4.7 FPC的降解实验
• 2.4.8 H&E细胞染色实验
• 2.4.9 细胞划痕实验
• 2.4.10 细胞迁移、侵袭实验
• 2.4.11 细胞周期、凋亡实验
• 2.4.12 细胞摄取实验
• 2.4.13 体外细胞转染实验
• 2.4.14 FPC小鼠瘤内基因转染
• 2.5 小结
• 2.6 参考文献
• 第三章 PC-Dox的合成及协同基因抗肿瘤活性的研究
• 3.1 前言
• 3.2 材料与仪器
• 3.2.1 材料和试剂
• 3.2.2 细胞、动物及工作溶液
• 3.2.3 仪器
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 阳离子聚合物PC的合成
• 3.3.2 PC-Dox的合成
• 1H-NMR）'>3.3.3 质子核磁共振波谱法（¹H-NMR）
• 3.3.4 紫外分光光度检测（UV）
• 3.3.5 PC-Dox/DNA复合物的制备
• 3.3.6 粒径和电位测定
• 3.3.7 透射电子显微镜观察
• 3.3.8 琼脂糖凝胶电泳
• 3.3.9 质粒的提取
• 3.3.10 PC-Dox体外细胞毒性实验
• 3.3.11 PC-Dox的细胞摄取研究
• 3.3.12 PC-Dox体外细胞转染
• 3.3.12.1 聚合物与质粒DNA的复合物对细胞转基因试验
• 3.3.12.2 荧光素酶的测定（使用荧光素酶检测试剂盒）
• 3.3.12.3 细胞裂解液的总蛋白测定
• 3.3.12.4 共聚物/DNA复合物转染的最佳N/P比值的确定
• 3.3.12.5 细胞转染pEGFP质粒后的绿色荧光的观察
• 3.3.13 荷瘤模型的建立
• 3.3.14 PC-Dox体内滞留实验
• 3.3.15 RT-PCR法测定p53 mRNA蛋白水平
• 3.3.15.1 细胞总RNA的提取
• 3.3.15.2 总RNA逆转录（RT）成cDNA
• 3.3.15.3 PCR扩增
• 3.3.15.4 电泳分析
• 3.3.16 Western blot免疫印迹测定细胞蛋白水平
• 3.3.17 PC-Dox体内抑瘤实验
• 3.3.18 心肌组织病理学检查
• 3.3.19 数据的统计学处理
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 PC-Dox的合成
• 1H-NMR）'>3.4.2 质子核磁共振波谱法（¹H-NMR）
• 3.4.3 紫外分光光度法（UV）
• 3.4.4 琼脂糖凝胶电泳
• 3.4.5 粒径和电位测定
• 3.4.6 PC-Dox体外细胞毒性实验
• 3.4.7 PC-Dox的细胞摄取实验
• 3.4.8 PC-Dox的瘤内滞留实验
• 3.4.9 PC-Dox体外细胞转染实验
• 3.4.10 RT-PCR测定p53蛋白变化
• 3.4.11 Western blot测定p27,p21,p53,bcl-2蛋白变化
• 3.4.12 体内抑瘤实验
• 3.4.12.1 裸鼠生存期比较
• 3.4.12.2 裸鼠的鼠重比较
• 3.4.12.3 裸鼠肿瘤大小比较
• 3.4.13 心肌组织切片检查
• 3.5 小结
• 3.6 参考文献
• 全文结论、创新点及未来研究方向
• 综述
• 参考文献
• 致谢