鹅脂蛋白脂酶（LPL）cDNA序列克隆及其在动物脂肪酶超家庭中的进化研究

论文摘要

脂蛋白脂肪酶（lipoprotein lipase，LPL）是脂质代谢的关键酶。本实验从天府肉鹅腿肌中抽取总RNA，通过RT-PCR反应扩增LPL基因的部分mRNA序列，分析LPL基因的结构特征及序列变异特点，探讨LPL基因的结构与功能及其在脂肪酶超家族基因间的系统进化关系。结果表明：1、获得的LPL基因序列长度为879bp，GenBank登录号为EF620913；编码293个氨基酸，核苷酸序列与鸡LPL的mRNA具有92.38％的相似性，与其它物种的序列也具有较高的相似性。2、鹅LPL基因的氨基酸组成包含20种氨基酸，其中亮氨酸含量（8.90％）最高，赖氨酸（7.88％）次之，色氨酸（1.37％）和蛋氨酸（1.74％）含量较低；鹅LPL基因293个氨基酸序列与鸡LPL基因间存在13个氨基酸位点的变异，占全部位点的4.44％；与哺乳动物间存在91个氨基酸变异位点，其中单态变异位点44个，占总变异位点数的48.35％。3、在天府肉鹅LPL蛋白中，α-螺旋（α-helix）所占的比例较高，为31.85％，扩展链（Extended strand）的比例为20.89％，无规卷曲（Random coil）的比例为47.26％，三者交替分布，形成LPL蛋白的二级结构。4、天府肉鹅LPL结构中存在4个二硫键、3个N-链接糖基化位点、1个肝素结合位点、1个脂蛋白酶催化三联体位点、1个脂质结合位点、1个介导脂蛋白与LDL受体结合的位点，1个PLAT结构域和1个对LPL二聚体形成必须的基序（motif），这与已经报道的其它物种的相一致。5、对脂肪酶蛋白超家族LPL、EL、HL、PL和PLA1 5个成员蛋白家族的进化分析表明，它们在结构上相似，来自一个共同的祖先基因；脂肪酶超家族在进化的过程中，形成2个进化分枝，即LPL-EL-HL分枝和PL-PLA1分枝，表明LPL、EL和HL基因间的亲缘关系较近；PL基因与PLA1间的分歧时间较晚。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 1. 文献综述
• 1.1 脂类代谢综述
• 1.1.1 脂类的消化和吸收
• 1.1.2 脂类的代谢和转运
• 1.1.3 鹅肥肝形成的机理和调控
• 1.2 脂蛋白脂酶基因的研究概况
• 1.2.1 LPL基因的结构
• 1.2.2 LPL基因的突变
• 1.2.3 LPL基因表达的表达和调控
• 1.3 LPL蛋白质的研究概况
• 1.3.1 LPL蛋白质的理化性质
• 1.3.2 LPL蛋白质的结构
• 1.3.3 LPL的合成和分泌
• 1.3.4 LPL的生理功能
• 1.4 脂肪酶超家族概况
• 1.5 实验目的和意义
• 2. 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验动物
• 2.1.2 时间与场地
• 2.1.3 样品采集
• 2.2 仪器和试剂
• 2.2.1 主要仪器设备
• 2.2.2 主要试剂
• 2.2.3 常用试剂的配制
• 2.3 试验方法
• 2.3.1 总RNA提取
• 2.3.2 RNA质量和浓度检测
• 2.3.3 反转录-PCR（RT-PCR）
• 2.3.4 测序
• 2.3.5 数据处理方法
• 3 结果和分析
• 3.1 提取的总RNA和RT-PCR反应结果
• 3.1.1 提取的总 RNA
• 3.1.2 RT-PCR反应结果
• 3.2 克隆测序得到的序列及同源性分析
• 3.2.1 测序结果
• 3.2.2 物种间序列的同源性比对
• 3.3 LPL氨基酸序列变异分析
• 3.3.1 LPL蛋白的氨基酸组分分析
• 3.3.2 LPL蛋白氨基酸变异分析
• 3.4 LPL蛋白结构域
• 3.4.1 LPL催化位点
• 3.4.2 二硫键位置
• 3.4.3 肝素结合区
• 3.4.4 N-链接糖基化位点
• 3.4.5 脂质结合位点
• 3.4.6 介导脂蛋白与LDL受体结合位点
• 3.4.7 PLAT结构域
• 3.4.8 介导二聚体形成位点
• 3.5 四川白鹅LPL蛋白二级结构的预测
• 3.5.1 LPL蛋白质的参数
• 3.5.2 LPL蛋白质二级结构预测和分析
• 3.6 脂肪酶超家族进化分析
• 3.6.1 脂肪酶超家族成员间的遗传距离
• 3.6.2 系统发育关系（NJ法）
• 4. 讨论
• 4.1 LPL的变异特点
• 4.1.1 序列的变异分析
• 4.1.2 第10外显子是否翻译
• 4.2 LPL的结构与功能预测
• 4.2.1 催化中心三联体的保守性分析
• 4.2.2 脂质结合位点分析
• 4.2.3 LPL高级结构的影响因素
• 4.2.4 LPL的催化机理预测
• 4.3 脂肪酶超家族的进化关系
• 4.3.1 分子进化的优点
• 4.3.2 脂肪酶超家族的遗传距离和分歧时间
• 4.3.3 脂肪酶超家族的进化关系
• 4.4 影响RT-PCR反应的因素
• 4.4.1 引物对PCR反应的影响
• 4.4.2 反应条件对RT-PCR反应的影响
• 4.4.3 反应体系对RT-PCR反应的影响
• 5. 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录:硕士研究生学习期间参与的科研项目和发表文章