IC162抑制CML细胞增殖、诱导CML细胞凋亡和化疗增敏作用及其机制研究

论文摘要

研究背景:慢性粒细胞白血病（Chronic myeloid leukemia,CML）是以费城染色体（Philadephia,Ph）为特征的多潜能造血干细胞恶性克隆性疾病,其恶性克隆的持续扩充与细胞增殖和凋亡速率不平衡有关。CML具有特征性的染色体异位t（9,22）（q34,q11）,产生Bcr/abl融合基因,编码蛋白质P210,后者在CML的发病过程中有重要作用。研究表明,P210可促进白血病细胞增殖,延缓其凋亡。对CML的治疗,传统方法包括羟基脲、a-干扰素、异基因造血干细胞移植及新近的酪氨酸激酶抑制剂,尽管治疗效果有很大改观,但仍有某些局限,特别是CML急变后治疗效果很差。因此,寻找CML急变后的新治疗方法仍是当前CML研究的目标。近年来,采用传统中药提取物探讨对白血病治疗的新途径引起了人们的关注,从传统中药提取的抗白血病药物如苦参碱（Matrine）、姜黄素（Curcumin）和冬凌草甲素（Oridonin）的体外试验表明可抑制多种白血病细胞增殖和诱导细胞凋亡,动物实验显示该类药物几乎无不良反应。新近上海交通大学附属瑞金医院血研所的研究显示冬凌草甲素在体内外能诱导具有t（8,21）的急性粒细胞白血病M2型（AML-M2）细胞株和原代细胞凋亡,而且副作用小,是一种潜在的抗白血病药物。因此筛选新型抗白血病的中药有效成分,确定其抗白血病的作用并探讨其机制,已成为当今白血病研究领域的热点。K562细胞株系人CML急性变细胞株,既具有急性白血病的细胞生物学行为,又具有CML细胞特有的本质,因此是体外研究筛选抗白血病药物疗效及机制的良好细胞模型。IC162是由单一中草药提纯出的单一化合物,分子量为368;具有类植物雌激素样作用（由于商业机密原因,其具体成份尚未解密）,为了确定IC162是否有抗白血病效应,本研究用IC162作用于K562细胞株及来自CML急粒变病人新鲜骨髓白血病细胞,观察IC162对K562细胞和CML急粒变病人原代白血病细胞是否具有抑制增殖、诱导凋亡和化疗增敏作用;并对其分子机制进行探讨。第一部分IC162对CML细胞的增殖抑制效应目的:观察不同浓度IC162对K562细胞和CML急粒变病人原代白血病细胞增殖以及细胞分裂周期的影响。方法:用台盼蓝拒染试验、MTT试验、集落形成抑制试验和流式细胞仪分析K562细胞增殖能力及DNA含量,观察不同浓度的IC162对CML细胞（K562细胞或CML急粒变病人原代白血病细胞）增殖的抑制率、集落形成和对细胞周期的影响。结果:（1）IC162以浓度依赖性方式有效地抑制CML细胞增殖,IC162抑制K562细胞活力的IC50值为8.2μmol/L;IC162抑制CML急粒变病人原代白血病细胞活力的IC50值为12.5～16.3μmol/L;（2）IC162能显著抑制K562细胞集落形成,并呈量效关系;（3）IC162增加G0/G1期K562细胞百分率,降低S期K562细胞百分率。结论:IC162能够有效地抑制CML细胞增殖,并呈药物浓度和时间依赖性,IC162可阻滞CML细胞在G0/G1期从而抑制CML细胞增殖。第二部分IC162对CML细胞的凋亡诱导效应目的:确定IC162能否诱导CML细胞凋亡。方法:用不同浓度的IC162作用于K562和CML急粒变病人原代白血病细胞,采用Hochest33258染色和AnnexinV-FITC/PI染色检测凋亡细胞的百分率;用Western印迹检测IC162干预后的K562细胞Caspase-3蛋白质表达。结果:（1）两种检测方法均证明IC162能以浓度依赖性方式诱导CML细胞凋亡;（2）IC162诱导K562细胞凋亡伴有Caspase-3蛋白表达上调和裂解激活。结论:IC162能以浓度依赖性方式诱导CML细胞凋亡;其诱导K562细胞凋亡的分子机制与Caspase-3蛋白表达上调和裂解激活有关。第三部分IC162对柔红霉素和高三尖杉酯碱抗K562细胞作用的化疗增敏效应目的:确定IC162对柔红霉素或高三尖杉酯碱的抗K562细胞增殖作用和凋亡诱导效应是否存在增敏效应。方法:用低剂量IC162（2μmol/L）分别与柔红霉素或高三尖杉酯碱合用干预K562细胞48小时,用MTT试验、AnnexinV-FITC/PI染色流式分析单药或联合用药对K562细胞增殖、早期凋亡的影响。结果:2μmol/L IC162分别与320μg/L柔红霉素或40μg/L高三尖杉酯碱共同干预K562细胞,与单用低剂量的IC162、单用柔红霉素或高三尖杉酯碱比较,联合用药抑制K562细胞增殖活力和诱导细胞凋亡效应更明显。结论:IC162对柔红霉素或高三尖杉酯碱抗K562细胞增殖和凋亡诱导具有增敏效应。第四部分IC162对K562细胞增殖抑制和凋亡诱导效应的分子机制目的:观察IC162作用下K562细胞增殖抑制和凋亡诱导过程中COX-2、Survivin、CyclinD2、CyclinE、p27、MMP-2、MMP-9和VEGF mRNA表达变化以及COX-2蛋白表达的影响,以部分揭示IC162抗白血病作用的分子机制。方法:（1）用Western blot分析IC162作用下K562细胞COX-2蛋白质表达水平;（2） Real-time PCR定量检测COX-2、Survivin、CyclinD2、CyclinE、p27、MMP-2、MMP-9和VEGF mRNA的表达量。结果:（1） IC162能以浓度依赖性方式抑制K562细胞COX-2和SurvivinmRNA以及COX-2蛋白的表达水平;（2） IC162能抑制K562细胞CyclinD2和CyclinE mRNA的表达,而上调、p27mRNA表达;（3） IC162能抑制K562细胞MMP-2、MMP-9和VEGF mRNA的表达。结论:IC162的抗白血病作用与其抑制COX-2、细胞周期调节相关基因和血管生成调节相关基因信号转导途径有关。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略词简表
• 前言
• 第一章 IC162对CML细胞的增殖抑制效应
• 1. 材料和方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 4. 结论
• 第二章 IC162对CML细胞的凋亡诱导效应
• 1. 材料和方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 4. 结论
• 第三章 IC162对柔红霉素和高三尖杉酯碱抗K562细胞作用的化疗增敏效应
• 1. 材料与方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 4. 结论
• 第四章 IC162对K562细胞增殖抑制和凋亡诱导效应的分子机制
• 1. 材料和方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 4. 结论
• 总结
• 参考文献
• 综述
• 致谢
• 在读期间发表的论文和课题申请