阿司匹林抑制宫颈癌Hela细胞增殖及其机制研究

论文摘要

目的:宫颈癌是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一,严重危害着女性的生命健康。据统计,2000年全球宫颈癌新发病例47万,死亡病例23万,现患病例140万。目前认为人乳头瘤病毒（HPV）感染是宫颈癌的主要致病原因。早期宫颈癌不论手术治疗还是放疗,效果均比较满意,但中晚期宫颈癌治疗效果差,化疗对中晚期宫颈癌的治疗效果是肯定的,但化疗药物如果长期大量的应用,药物在作用于肿瘤的同时还可能引发严重的副反应,而且可导致肿瘤的耐药性。因此寻找更为有效的治疗药物及方法是一个迫切需要解决的问题。阿司匹林为非甾体类消炎药,其药理作用为抑制环氧化酶的活性,降低前列腺素的合成。文献报道阿司匹林对肿瘤细胞的生长有抑制作用,可以抑制食管癌、胃癌、结肠癌、卵巢癌、肝癌、乳腺癌、肺癌、淋巴瘤以及子宫内膜癌的生长;最近流行病学研究证实,阿司匹林及其它非甾体类消炎药具有降低肿瘤发病率的作用,肿瘤组织中COXs过度表达,PGE2产生过多,可刺激肿瘤细胞的增殖及机体的肿瘤免疫机能降低。目前国内外有关阿司匹林抗宫颈癌的研究均很少。本研究以人宫颈癌Hela细胞为研究对象,探讨阿司匹林对宫颈癌Hela细胞增殖、诱导其凋亡情况,检测bcl-2和bax基因的表达变化,观察凋亡细胞形态学变化,进一步探讨阿司匹林抑制宫颈癌Hela细胞增殖机制,以期对临床治疗宫颈癌提供理论依据。方法:1.细胞培养:常规方法复苏宫颈癌Hela细胞,接种于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中培养,置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱内培养。2.流式细胞仪检测（FCM）:以含0、1、5、10mmol/L浓度阿司匹林的培养液培养Hela细胞48小时,用流式细胞仪定量分析经不同浓度阿司匹林处理的细胞凋亡率和细胞周期变化情况。3.反转录聚合酶链反应（RT-PCR）:提取Hela细胞RNA,反转录扩增后取扩增产物,经2%琼脂糖凝胶电泳后,用凝胶成像系统观察结果,检测用药前后凋亡相关基因bcl-2和bax的表达。4.DNA Ladder测定:提取Hela细胞DNA,用1.5%琼脂糖凝胶电泳进一步检测Hela细胞发生的DNA降解。5.细胞增殖抑制实验（MTT还原法）:用含0、0.5、1、5、10mmol/L浓度阿司匹林的培养液分别培养Hela细胞24、48、72、96小时,用MTT还原法检测细胞增殖抑制情况。6.细胞形态学观察:用含0、1、5、10mmol/L浓度阿司匹林的培养液培养Hela细胞72小时,倒置像差显微镜观察并用Giemsa染色后在光学显微镜下观察凋亡细胞形态学变化。结果:1.流式细胞仪检测结果:流式细胞仪检测表明经不同浓度阿司匹林作用48小时后,与对照组相比,随阿司匹林浓度增加,实验组Hela细胞凋亡率升高明显（P<0.05）,细胞周期发生明显变化;随着阿司匹林浓度的增加,G0/G1期细胞比例减少,而G2/M期细胞比例增加（P<0.05）。说明阿司匹林在G2/M期阻断Hela细胞增殖。2.阿司匹林对Hela细胞bcl-2和bax基因mRNA表达的影响:阿司匹林作用于Hela细胞前后,细胞中的bcl-2基因mRNA表达明显降低,而bax基因mRNA表达明显升高,两种基因表达差异有统计学意义（P<0.05）。3.阿司匹林作用Hela细胞后细胞基因组DNA变化:提取对照组和实验组细胞DNA,经1.5%琼脂糖凝胶电泳显示实验组DNA出现降解,呈明显的梯状条带,表明阿司匹林能诱导Hela细胞凋亡。4.阿司匹林对Hela细胞增殖的抑制作用:采用MTT法检测细胞增殖抑制率,描绘生长柱状图和曲线图可知,经不同浓度阿司匹林处理后的Hela细胞生长缓慢,表现出明显的生长抑制,并呈作用浓度和时间的依赖性,而对照组细胞生长良好。5.阿司匹林作用Hela细胞后形态学变化:倒置像差显微镜观察,对照组细胞生长良好,细胞透明,密度较大,呈复层性生长,细胞呈梭形或多角形,易融合形成集落,细胞浆内颗粒较少,细胞核隐约可见;实验组细胞密度明显减小,细胞颗粒较多,细胞间界线模糊,漂浮细胞数量增加,存活细胞明显减少。经Giemsa染色后进行光镜观察,可见细胞形态也出现明显改变,对照组细胞形态饱满、伪足伸展,细胞核染色均匀,核仁清晰可见;实验组细胞中出现形态变小、伪足回缩,细胞质浓缩、变圆,核仁染色不均,核物质边集,高倍镜下可见凋亡细胞体积缩小,细胞膜皱缩,染色体浓缩,细胞核固缩、断裂,核仁消失,形成大小不等的凋亡小体。与对照组相比,凋亡细胞染色加深,尤其细胞膜染色更明显。在光镜下计凋亡小体百分数,结果表明,随着浓度增加,细胞凋亡率增加,统计学分析差异有显著性（P<0.05）。结论:1.本研究发现阿司匹林可抑制宫颈癌Hela细胞增殖并诱导其凋亡;2.阿司匹林可诱导宫颈癌Hela细胞凋亡的机制可能与下调bcl-2和上调bax基因表达有关;3.可在G2/M期阻断Hela细胞增殖;4.光学显微镜下可观察到凋亡形态学变化;5.阿司匹林作为宫颈癌化疗的辅助用药可能会增加化疗药的作用,减少肿瘤对化疗药的耐药性。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 研究论文 阿司匹林抑制宫颈癌Hela 细胞增殖及其机制研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述 阿司匹林抗癌机制的研究进展
• 致谢
• 个人简历