Rep-PCR基因指纹图微生物源追踪方法研究与应用

论文摘要

水源性病原体危害人类健康,而粪便污染是造成水中病原体污染的最主要原因,确定粪便污染来源对于健康危害评估及对污染水体的整改和管理至关重要。传统的监测方法只能对水体做出卫生学评价,而无法查找水体中污染物的来源。Rep-PCR基因指纹图微生物源追踪技术则可以通过不同来源指示菌的源特征性基因指纹图,结合统计学分析来查找水体中粪便污染来源。目的本研究旨在建立桂五水库地区已知源特征性rep-PCR基因指纹库,并用正确归类率等统计学方法对其进行评价,检测桂五水库水样标本,追踪其为期一年的粪便污染来源。方法春、夏、秋和冬四季分别采集桂五水库周边村落已知来源的人和动物（家禽、家畜和野生动物）新鲜粪便标本,分离并确认指示菌大肠杆菌,以BOXA1R为引物进行PCR扩增。用Bionumerics 4.0软件对rep-PCR基因指纹图进行判别分析和多元方差分析并计算正确归类率,以评价该方法对不同种属来源指示菌的区分效果。按月采集水样标本,膜过滤法分离指示菌,进行rep-PCR扩增,将水样中指示菌rep-PCR基因指纹图与已知源特征性rep-PCR基因指纹库进行统计学比对,判断桂五水库中粪便污染来源。结果1.从650份已知源粪便标本中分离2705株指示菌,筛选并建立已知源特征性rep-PCR基因指纹库。2.将已知源库分为10类、5类、3类和2类统计分析,各种属平均正确归类率分别为:68.13%、74.76%、82.36%和86.03%。判别分析和多元方差分析结果显示rep-PCR基因指纹图能将已知源不同来源指示菌区分开。3. 84份未知源水样分离到534株指示菌,rep-PCR实验得到502条特征指纹图,指其中477条（95.02%）指纹图可判别污染来源。判别分析结果显示:桂五水库中粪便污染来源种类多,人、鸡、牛、羊、猪、鸭、鹅、野生动物、狗和鸽各占27.88%、15.51 %、11.53%、9.22%、8.39%、8.18%、6.01%、5.66%、4.19%和3.35%,其中人、鸡和牛3类共占54.92%。结论筛选并建立的已知源特征性rep-PCR基因指纹库具有宿主特异性,能较好地区分水体中指示菌的不同来源;水体标本监测显示桂五水库粪便污染来源种类多,其中人、鸡和牛相对较多,提示应对桂五水库地区加强人、家禽和家畜动物粪便的无害化管理。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一部分 已知源指示菌特征数据库建立
• 一 材料和方法
• 二 结果
• 三 讨论
• 小结
• 第二部分 桂五水库污染来源监测分析
• 一 材料与方法
• 二 结果
• 三 讨论
• 小结
• 总结
• 参考文献
• 附录主要缩略词
• 发表文章情况
• 综述
• 参考文献
• 文章
• 致谢